[发明专利]一种新的CMV、PVY快速检测方法

摘要

本发明公开了一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：（1）抗体包被；（2）CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；（3）免疫捕获‑环式等温扩增检测；（4）免疫捕获‑环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，孵育，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中孵育，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV和PVY特异反转录引物，反转录反应在42℃下进行60min，然后吸出10μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，整个反应在65℃下进行90min。

主权项

一种新的CMV、PVY快速检测方法，其特征在于：包含以下步骤：抗体包被：PCR管使用2%‑5%戊二醛和HCl处理，之后分别使用ddH2O和碳酸包被缓冲液冲洗，使用包被缓冲液以1:200的比例稀释抗体，取稀释后的抗体加入处理好的PCR管，2‑8℃孵育过夜，之后以PBST清洗备用；CMV和PVY免疫捕获环式等温扩增引物的设计；免疫捕获‑环式等温扩增检测，样品匀浆：取0.1‑0.2g发病样品，以1:10的比例加入抽提缓冲液，然后研磨匀浆，离心取上清液；免疫捕获‑环式等温扩增反应过程：将烟草叶片匀浆液加入抗体包被的PCR管中，37℃孵育1‑3h，孵育结束后倒掉匀浆液，然后用无菌水冲洗，在PCR管中加入无菌水，在金属浴中变性5‑10min，然后迅速转移至冰上，然后按照反转录酶产品说明书加入包括反转录酶的反转录试剂和CMV 和PVY特异反转录引物，定容体积至100μl，转录反应45min至1h，然后吸出5‑20μl反转录产物作为等温扩增反应底物，补充等温扩增试剂和无菌水至25μl体系，个反应在60‑65℃条件下进行60‑90min。