[发明专利]一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列

摘要

本发明涉及一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法以及该方法所用的核酸序列，测血管内皮生长因子的方法大致为：在聚乙烯微孔上，形成VEGF与适配体和抗体形成抗体‑蛋白‑适配体的夹心结构，同时在适配体的末端包含有一段18碱基的延长序列，然后利用合成的两段蔗糖转移酶标记的辅助探针，这两段酶标探针以18碱基的延长序列为模板，引发链杂交扩增反应，从而在微孔中固定上大量的蔗糖转移酶，这些酶催化蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪指示产生的葡萄糖的浓度，本发明的检测方法便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高，且能有效的测出待分析目标物白血管内皮生长因子的含量。

主权项

1.一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，其特征在于：它包括以下步骤：1)将VEGF抗体在聚苯乙烯微孔板中固定并封闭；2)目标物VEGF与VEGF抗体的结合：将不同浓度的VEGF标准溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应；3)核酸适配体‑VEGF‑VEGF抗体夹心结构的形成：将一定浓度的核酸适配体缓冲溶液加入到步骤2)所得的聚苯乙烯微孔板中，进行孵育反应，4)制备活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液；5)制备sulfo‑SMCC活化的蔗糖转移酶溶液；6)制备蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液：将步骤4)所得的活化的核酸A1溶液以及活化的核酸A2溶液分别与步骤5)所得的sulfo‑SMCC活化的蔗糖转移酶溶液进行混合、反应得到蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液；7)链杂交扩增反应的引发：将步骤6)所得的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液分别用杂交缓冲液调至浓度为0.4‑2μM，以30‑50μL/孔的添加量分别将浓度为0.4‑2μM的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1溶液以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2溶液加入到步骤3)所得的聚苯乙烯微孔板中，其中每孔中加入的蔗糖转移酶功能化的核酸探针A1以及蔗糖转移酶功能化的核酸探针A2的摩尔比为1:1，之后在37.0‑37.5℃下孵育0.5‑1小时，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3‑5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150‑200μL；8)利用血糖仪进行检测：以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入步骤7)所得的聚苯乙烯微孔板中，反应10～60分钟，之后取10～20μL的反应产物分别滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到与不同浓度的VEGF标准溶液相对应的不同血糖仪读数；9)绘制VEGF检测标准曲线并获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程：根据步骤8)所得的血糖仪读数，绘制血糖仪读数与VEGF浓度的标准曲线，根据标准曲线，获得血糖仪读数与VEGF浓度的线性回归方程；10)VEGF待测样的检测：以30‑100μL/孔的添加量，将未知浓度的VEGF待测溶液加入到步骤1)所得的聚苯乙烯微孔板中，在37.0‑37.5℃下孵育0.5‑1小时后，用冲洗缓冲液冲洗聚苯乙烯微孔板，冲洗3‑5次，每次冲洗时冲洗缓冲液的用量为150‑200μL，接着重复步骤3)、步骤7)后，以30～40μL/孔的添加量，将1～2M的蔗糖溶液加入聚苯乙烯微孔板中，反应15～20分钟后，取10～20μL的反应产物滴加到血糖仪的试纸表面进行检测，得到血糖仪读数，将该血糖仪读数代入步骤9)所得的线性回归方程中即得VEGF待测样中VEGF的浓度；其中，所述核酸适配体的序列为：5'‑TGTGGGGGTGGACGGGCCGGGTAGAACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3'。所述核酸A1的序列为：5'‑TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT‑3'；所述核酸探针A1的序列为：5'‑SH‑TTTTTTTACTCCCCCAGGTGC CCCTCAGACCCTTTTAGT‑3'所述的核酸A2的序列为:5'‑TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3'；所述核酸探针A2的序列为：5'‑SH‑TTTTTTGCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG‑3'所述的杂交缓冲液以及冲洗缓冲液均为含有0.05～0.2M氯化钠和0.007～0.02M氯化镁的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0～7.6，浓度为0.05～0.2M。