[发明专利]禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法

摘要

本发明提供一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离。本发明的方法可以分离出高纯度的透明质酸，直接从禽类蛋壳中提取透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。

主权项

1.一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐或EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱或阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素或硫酸乙酰肝素和硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris‑HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；ⅱ)将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，煮沸后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素混合物沉淀析出；将透明质酸与硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q‑Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用0.05～5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素和/或硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素或硫酸皮肤素；所述采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质，具体包括：将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS缓冲液的质量比为1：(10～80)；加入链霉蛋白酶Actinase E，于37～39℃水浴处理12～28小时，Actinase E与壳膜的质量比为1：(2～50)；于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：(70～100)，于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶于53～63℃水浴处理6～24小时，酶与壳膜质量比1：(80～100)，于90～95℃灭活碱性蛋白酶10～40分钟；用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用；所述用阴离子交换柱或阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，具体包括：将上清液加入阴离子交换柱，或往上清液中加入阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为(5～30)：1；依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂上的杂质，最后3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量为3～10kDa；或者将总糖胺聚糖盐溶液用4～5倍体积的甲醇于‑20～8℃沉淀12～18小时，用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖；或者所述用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖，具体包括：直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01～0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后于2～8℃放置过夜，于2～8℃用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，用含5～20wt％乙酸钾的70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖。