[发明专利]一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法

摘要

本发明涉及一种循环肿瘤细胞的鉴定方法，包括：利用磁性纳米球偶联上特异性识别肿瘤细胞的抗体，两种不同颜色的荧光纳米球分别修饰特异性识别肿瘤细胞和白细胞的抗体，从而得到三种免疫功能纳米球。将上述三种免疫功能纳米球同时加入到待检测的全血体系中，实现了对循环肿瘤细胞的同时捕获和标记，通过简单的磁分选，富集后的细胞直接在荧光显微镜下观察，达到鉴定的目的。鉴定方法操作简单，循环肿瘤细胞损失少；免疫功能纳米球对目标细胞活性几乎没有影响，93%的肿瘤细胞在鉴定后仍保持很好的生物学活性，可以进行体外培养。本发明为临床癌症患者的预后，复发监测和个性化治疗提供了有效方法。

主权项

1.一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法，是非疾病诊断目的，其特征在于：由如下步骤组成：1)免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球的制备：磁性纳米球的制备：首先利用EDC/NHS活化苯乙烯丙烯酰胺聚合球表面的羧基，使其与聚乙烯亚胺的氨基共价反应；随后利用γ‑Fe2O3的Fe与聚乙烯亚胺的伯胺的配位作用，将γ‑Fe2O3组装到聚合球表面；再重复组装聚乙烯亚胺和γ‑Fe2O3直至组装5层γ‑Fe2O3；最后，将制得的磁性纳米球通过四乙氧基硅氧烷和(3‑氨基丙基)三乙氧基硅氧烷处理在其表面包覆一层硅壳并引入氨基，再与丁二酸酐反应在磁性纳米球表面引入羧基；所得的磁性纳米球的粒径为380nm；荧光纳米球制备：利用疏水相互作用将不同发射波长的油溶性量子点超声包埋到表面具有羧基的苯乙烯丙烯酰胺聚合球的疏水空腔内部从而制得发射不同颜色荧光的两种荧光纳米球；所得的荧光纳米球粒径为250nm以下；制得的磁性纳米球和荧光纳米球表面富含羧基，采用EDC/NHS活化的方法，将其表面羧基活化，与抗体的氨基共价结合，得到免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球；磁性纳米球和其中一种荧光纳米球都偶联特异性识别肿瘤细胞的抗体，另一种荧光纳米球偶联特异性识别白细胞的抗体；每毫克磁性/荧光纳米球偶联抗体的量都为5μg；2)将上述免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球同时加入到待测的全血样品中，其中偶联了特异性识别肿瘤细胞的抗体的免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球用量比为3:2；孵育时间为2.5～30min；磁分选，用含有核酸染料的缓冲溶液洗涤三遍，再用缓冲溶液洗涤两遍后，用缓冲液重悬捕获的细胞，核酸染料为标记活细胞的核酸染料，洗涤浓度为其工作浓度；3)利用倒置荧光显微镜鉴定磁捕获的细胞，被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色、核阳性同时未被修饰了特异性识别白细胞的抗体另一种颜色荧光纳米球识别的细胞认为是肿瘤细胞；而被修饰了特异性识别白细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色，核阳性同时未被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记的细胞判定为白细胞，完成循环肿瘤细胞的鉴定。