[发明专利]亲和层析填料动态载量测定方法

摘要

本发明公开了一种亲和层析填料动态载量测定方法，步骤包括：1)用流穿液配制不同浓度纯化蛋白样品；2)制备装填填料的过滤板；3)样品加到过滤板上并孵育；4)抽滤，收集流穿液并检测蛋白浓度，拟合吸附等温线；5)装填层析柱，上样，洗脱，记录紫外出峰的保留体积和电导出峰保留体积，短接层析柱，记录电导出峰保留体积，计算填料外排水孔隙率、全透过孔隙率及填料孔隙率；6)测定蛋白水合分子平均半径；7)计算动态载量。本发明结合亲和填料和单克隆抗体的性质特点，利用高通量筛选技术研究吸附等温线和吸附动力学模型，由单克隆抗体的静态载量预测亲和层析填料的动态载量，不仅耗时短，成本低，而且测定结果的准确性高。

主权项

1.亲和层析填料动态载量测定方法，其特征在于，步骤包括：1)将亲和层析纯化后的蛋白按比例加入到亲和层析过程中收集的发酵液的流穿液中，配制成不同浓度梯度的样品；2)制备亲和层析填料并装填到过滤板上，用亲和层析平衡缓冲液平衡亲和层析填料，置换填料中的保存液；3)将步骤1)制备的样品加到步骤2)装填了亲和层析填料的过滤板上，并进行孵育；4)真空抽滤，收集流穿液，并检测流穿液中的蛋白浓度，然后以蛋白浓度为X轴，对应的吸附到亲和层析填料上的蛋白载量为Y轴，利用Langmuir吸附等温线进行拟合，拟合公式为：其中，c为流穿液中蛋白浓度，q为吸附到亲和层析填料上的蛋白载量，qm为最大静态载量，K为解离常数；5)装填对应亲和层析填料的实验室规格的层析柱，分别用PVP‑K90和NaCl上样，然后再分别进行洗脱，记录紫外出峰的保留体积和电导出峰保留体积，再将层析柱短接，记录电导出峰保留体积，计算亲和层析填料的外排水孔隙率、全透过孔隙率及该亲和填料的孔隙率，计算公式如下：ε＝(V‑Vv)/(Vc‑Vv)εb＝(Vb‑Vv)/(Vc‑Vv)εp＝(εb‑ε)/(1‑ε)其中，Vc为层析柱体积，V为紫外出峰的保留体积，Vb为电导出峰保留体积，Vv为短接层析柱时电导出峰保留体积，ε为亲和填料的外排水孔隙率，εb为亲和填料的全透过孔隙率，επ为亲和填料的孔隙率；6)将亲和层析纯化后的蛋白换液到亲和层析平衡缓冲液中，进行动态光散射实验，测定蛋白水合分子平均半径；7)计算亲和层析填料的动态载量，计算公式为：Kp＝0.865(1‑2.1λm+2.09λm3‑0.984λm5)τ＝(2‑εp)2/εp当Nτ1＞2.5时，τ1＝1‑1.03/N当Nτ1＜2.5时，τ1＝0.364N‑0.0612N2+0.00423N3Kd＝1/K其中，rpore为亲和填料孔径半径，Kp为空间阻力系数，De为有效扩散系数，D为单克隆蛋白自由扩散系数，L为层析柱柱高，u为线速度，rp为亲和填料颗粒半径，L/u的值为保留时间，c0为发酵液初始蛋白浓度，rm为蛋白水合分子平均半径。