[发明专利]亲和层析填料动态载量测定方法

说明书

本发明公开了一种亲和层析填料动态载量测定方法，步骤包括：1)用流穿液配制不同浓度纯化蛋白样品；2)制备装填填料的过滤板；3)样品加到过滤板上并孵育；4)抽滤，收集流穿液并检测蛋白浓度，拟合吸附等温线；5)装填层析柱，上样，洗脱，记录紫外出峰的保留体积和电导出峰保留体积，短接层析柱，记录电导出峰保留体积，计算填料外排水孔隙率、全透过孔隙率及填料孔隙率；6)测定蛋白水合分子平均半径；7)计算动态载量。本发明结合亲和填料和单克隆抗体的性质特点，利用高通量筛选技术研究吸附等温线和吸附动力学模型，由单克隆抗体的静态载量预测亲和层析填料的动态载量，不仅耗时短，成本低，而且测定结果的准确性高。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及纯化工艺中亲和层析填料的动态载量的测定方法。

背景技术

动态载量测定是亲和层析中重要的工艺开发步骤。传统的动态载量测定方法需要考虑不同的保留时间以及上样浓度等因素，在实验室规模的亲和层析柱上完成相关测定工作。这种测定方法的缺点是工艺时间长，材料消耗量大。

采用高通量技术可以大大节约工艺开发时间以及实验材料，节约工艺开发成本。但是，利用高通量技术测定的亲和填料载量都是静态载量，与动态载量的结果不完全相同，需要考虑蛋白与亲和填料间的动力学行为，对动态载量进行预测。

采用吸附等温线和吸附动力学模型可估算亲和填料的动态载量。目前亲和层析理论模型的研究主要集中在Langmuir吸附等温线、孔扩散、表面扩散和平行扩散等模型上。在确定传统吸附等温线以及吸附动力学参数时，一般采用批次吸附或者浅床流化床吸附的研究方法。众所周知，这种传统动力学研究方法样品需求量大，实验耗时长，不利于大分子吸附动力学实验的开展。此外，传统动力学研究中，需要研究不同的吸附动力学模型得到准确的有效扩散系数，从而对流穿曲线进行拟合，预测动态载量的值。但是由于单克隆抗体结构复杂，亲和填料结构也不尽相同，导致模型拟合过程十分复杂，加大了运用到生物制药下游纯化亲和层析动态载量的工艺开发过程的难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种亲和层析填料动态载量测定方法，该方法不仅简单，而且准确。

为解决上述技术问题，本发明的亲和层析填料动态载量测定方法，步骤包括：

1)将亲和层析纯化后的蛋白按比例加入到亲和层析过程中收集的发酵液流穿液中，配制成不同浓度梯度的样品；

2)制备亲和层析填料并装填到过滤板上，用亲和层析平衡缓冲液平衡亲和层析填料，置换填料中的保存液；

3)将步骤1)制备的样品加到步骤2)装填了亲和层析填料的过滤板上，并进行孵育；

4)真空抽滤，收集流穿液，并检测流穿液中的蛋白浓度，然后以蛋白浓度为X轴，对应的吸附到亲和层析填料上的蛋白载量为Y轴，拟合吸附等温线；

5)装填对应亲和层析填料的实验室规格的层析柱，分别用PVP-K90和NaCl上样，洗脱， 记录紫外出峰的保留体积和电导出峰保留体积，再将层析柱短接，记录电导出峰保留体积，计算亲和层析填料的外排水孔隙率、全透过孔隙率及该亲和填料的孔隙率；

6)将亲和层析纯化后的蛋白换液到亲和层析平衡缓冲液中，进行动态光散射实验，测定蛋白水合分子平均半径；

7)计算亲和层析填料的动态载量。

上述步骤4)，可以利用Langmuir吸附等温线进行拟合，拟合公式为：

其中，c为流穿液中蛋白浓度，q为吸附到亲和层析填料上的蛋白载量，q_m为最大静态载量，K为解离常数。

上述步骤5)，亲和层析填料的外排水孔隙率、全透过孔隙率及该亲和填料的孔隙率的计算公式为：