[发明专利]尿液中修饰核苷的检测方法

摘要

本发明提供了一种尿液中修饰核苷的检测方法，具体包括如下步骤尿液预处理后保存于滤纸片上，后通过萃取得到待测样本；将所述待测样本通过液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量。本发明提供的检测方法中，通过将尿液保存于滤纸片上再通过萃取过程，运用液质联用方法，能够快速、有效地对尿液中的修饰核苷进行定性和定量检测。由于将尿液保存于滤纸片上，将尿液样品转换为固体形式进行保存，稳定性大大提高，从而避免微生物污染检测样品。而且，本发明提供的方法也比现有的冷冻法更为简易、方便。

主权项

尿液中修饰核苷的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)尿液预处理后保存于滤纸片上，后通过萃取得到待测样本；(2)将所述待测样本通过液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；步骤(1)中，所述萃取的步骤具体包括：将滤纸片放入甲醇水混合溶液中经超声、离心后取上清液作为待测样本；步骤(2)具体包括：(21)称取标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；(22)称取内标物，用甲醇水溶液溶解后分别加入所述标准液中，超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；(23)将所述待测样本和所述待测标准液通过液质联用检测，得到修饰核苷的种类和含量；步骤(23)中，所述液质联用检测的液相条件为：流速为0.1‑1.0mL/min；进样量1‑20μL；键合相色谱柱；柱温20‑40℃；A和B作为流动相，其中A为甲醇水溶液，B为甲酸甲醇溶液，梯度洗脱程序为0‑0.5min，A：97％、B：3％；0.5‑3min，A：97～5％、B：3～95％；3‑3.01min，A：5‑97％、B：95‑3％；3.01‑11min，A：97％、B：3％；11.01min，A：97％、B：3％；13min，A：97％、B：3％；质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，雾化气流速8‑20L/min，气帘气流速8‑20L/min，碰撞气流速5‑15L/min，离子源电压2000‑4000V，离子源温度200‑400℃；步骤(21)中，所述标准品包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1‑甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、1‑甲基次黄嘌呤核苷、5‑甲基尿苷、黄嘌呤核苷、3‑甲基尿苷、1‑甲基鸟苷、6‑甲基腺苷、2‑甲基鸟苷、N4‑乙酰基胞苷和N2,N2‑二甲基鸟苷；步骤(22)中，所述内标物为8‑溴鸟苷；所述液相条件中，流动相A为0.1‑10％甲醇水溶液，B为0.1‑10％甲酸甲醇溶液；所述液相条件中，所述键合相色谱柱为C18或C8色谱柱，规格为(50‑100)mm×(1.8‑3)mm，(1.8‑3)μm；步骤(1)中，所述离心的转速为10000‑18000rpm，时间为5‑20min；步骤(1)中，所述尿液预处理后保存于滤纸片上的步骤具体包括：向尿液中加入8‑溴鸟苷混合后滴于滤纸片上，并风干3小时以上；所述修饰核苷包括假尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷、1‑甲基腺苷、尿嘧啶核苷、腺嘌呤核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、1‑甲基次黄嘌呤核苷、5‑甲基尿苷、黄嘌呤核苷、3‑甲基尿苷、1‑甲基鸟苷、6‑甲基腺苷、2‑甲基鸟苷、N4‑乙酰基胞苷和N2,N2‑二甲基鸟苷。