[发明专利]一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法

摘要

本发明公开了一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法。该方法先将被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；然后对样品进行多酶联合处理提取，依次包括样品的胃蛋白酶处理、胰蛋白酶处理、链霉蛋白酶E处理和植物复合水解酶Viscozyme L处理，再利用冷乙酸乙酯萃取的方式进行提取液的还原糖的去除，最后用现有方法进行抗氧化物质含量及活性分析，本发明通过对被测样品的抗氧化活性物质的提取中采用模拟人体消化过程的多酶联合酶解方法，再结合细胞水平的抗氧化活性分析方法，从而建立一种生物相关性更强，更接近动物试验水平的抗氧化活性评价方法。

主权项

1.一种果蔬食品及功能保健品抗氧化活性的评价方法，其特征在于包括如下步骤：（1）被测样品的预处理：将待测原料配置成水匀浆或直接取口服液类保健食品；（2）样品的多酶联合处理提取：a、样品的胃蛋白酶处理将预处理水匀浆或保健口服液用HCl调节pH至0.5~2.0，取胃蛋白酶用HCl水溶液溶解后加入，用锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，于37℃水浴摇床里反应0.5~2h，离心，分离出上清液A和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液加入5~30mg胃蛋白酶；b、样品的胰蛋白酶处理经胃蛋白酶处理并离心分离后的残渣，加入蒸馏水，用NaHCO3水溶液调节pH至6.5~8；然后取胰蛋白酶，溶于Na2CO3 /NaHCO3 缓冲液后加入；锡箔纸包裹避光，不断通入氮气，在37℃的恒温水浴摇床里反应1~6h；反应结束，离心，分离出上清液B和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶处理得到的残渣加入80‑120 mL蒸馏水；每mL缓冲液加入胰蛋白酶1‑5mg；c、样品的链霉蛋白酶 E处理经胰蛋白酶处理并离心后所得残渣再加入蒸馏水，采用0.1M的NaOH水溶液调节pH为7.0‑9.0，加入链霉蛋白酶 E，在37℃下酶解0.5‑2h，离心，分离出上清液C和残渣；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液胃蛋白酶和胰蛋白酶处理得到的残渣加入80‑120mL蒸馏水和0.5‑5mg链霉蛋白酶 E；d、样品的植物复合水解酶Viscozyme L处理将步骤c反应物离心后所得残渣，加入蒸馏水，采用0.5M的HCl水溶液调节pH至3.0‑4.5，加入诺维信复合植物水解酶（Viscozyme L），在37℃的恒温水浴摇床里反应作用时间为8‑18h；酶解结束，离心分离，倒出并收集上清液；底部残渣加入蒸馏水，搅拌，离心，取上清液后，残渣再1次用水提一次；合并3次离心上清液，为上清液D；每100毫升预处理水匀浆或保健口服液经步骤a‑c处理得到的残渣加入80‑120mL蒸馏水和20‑100 μL诺维信复合植物水解酶（Viscozyme L）；e、提取液的还原糖的去除分别将上清液A、B、C和D合并，在40℃水浴下真空浓缩，浓缩到体积为50mL，加入1‑3倍体积的冷乙酸乙酯萃取，离心取乙酸乙酯层；余下水相再萃取2次，合并3次萃取液，真空浓缩挥干乙酸乙酯后加入蒸馏水定容至10mL，用样品管分装于‑80℃冰箱冻存待测；（3）抗氧化物质含量及活性分析a、总多酚含量的测定参照Folin‑Ciocalten比色法，以没食子酸为标准品，采用分光光度法对总酚类物质的含量进行测定；b、总黄酮含量的测定采用SBC比色法，以儿茶素为标准品，通过一系列反应将所有的黄酮类化合物都转换成花青素的结构，再与香草醛发生显色反应在490nm波长下进行比色测定；总黄酮含量用儿茶素当量来表示；c、CAA测定按照CAA进行抗氧化活性的测定；荧光染料DCFH‑DA 进入细胞后被细胞内酯酶水解成DCFH，DCFH被自由基引发剂AAPH产生的自由基ROO·氧化成荧光化合物DCF，通过荧光的降低程度来衡量抗氧化能力。