[发明专利]一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法

摘要

本发明属于电化学传感器领域，具体涉及一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法。首先，将羧基化磁珠MB与氨基修饰的ATP适体DNA1结合生成MB-DNA1复合物，随后使得修饰有SH的CV适体DNA2、ATP适体互补链DNA3与纳米金结合，并加入CV生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs，然后，MB-DNA1复合物与探针反应，通过DNA1与DNA3结互补作用，生成探针修饰的磁珠。接着向探针修饰的磁珠溶液中加入含ATP的样品溶液，之后进行磁分离，取上清液。随后，将上清液滴在金纳米粒子修饰的电极上。将所得到的电极作为工作电极同参比电极、指示电极插入电解质溶液中，进行电化学测定。根据电化学信号强弱，实现ATP含量的测定。

主权项

一种基于磁珠分离和DNA标记金纳米粒子探针检测ATP含量的方法，包括以下步骤：(1)金纳米粒子的制备制备金纳米粒子所用的玻璃容器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶等用王水浸泡30分钟，然后用二次水冲洗干净，烘干备用；在250mL圆底烧瓶中加入100mL，0.01％的HAuCl₄，搅拌加热至沸腾，然后快速加入500μL，1％的Na₃C₆H₅O₇，再加热10分钟，搅拌15分钟，冷却至室温，转移在棕色瓶中保存；(2)探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs的制备在2mL的离心管中加入10μL 1.0×10^‑5M的DNA3、30μL 1.0×10^‑5M的DNA2和10μL pH 5.2的醋酸缓冲溶液以及10μL 10mM的TCEP反应1h；随后向其中加入制备好的1mL的AuNPs溶液，放入摇床轻摇反应16h；使巯基DNA与AuNPs通过Au‑S键连接起来，生成DNA2/DNA3/AuNPs；再向其中加入过量的CV溶液，37℃条件下恒温反应65min，生成探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs；(3)MB‑DNA1的制备取10μL羧基化磁珠至1mL的小离心管管中，并用100μL pH 8.0的Tris‑HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散于Tris‑HCl缓冲溶液中得磁珠悬浮液；将40mM EDC和10mM NHS加到处理好的磁珠悬浮液中，将该混合物在室温下轻摇1h；然后，将50μL，5.0×10^‑6M的DNA1加到上述所得溶液中；在4℃条件下，振动反应12h；反应完成后，将所得产物经过磁性分离，并将得到的DNA1修饰磁珠产物MB‑DNA1分散在1mL pH 7.4的Tris‑HCl缓冲溶液中；(4)ATP的检测在1.5mL样品管中加入制备好的100μL探针CV/DNA2/DNA3/AuNPs溶液以及100μL MB‑DNA1溶液，反应1h；然后用pH 7.4的磷酸缓冲溶液洗三次，并将其分散在1mL pH 7.4的Tris‑HCl缓冲溶液中；然后将含有不同浓度的ATP溶液加入，在37℃条件下反应一定时间，经过磁性分离，取磁性分离清液10μL均匀滴涂在工作电极上，室温下静置1小时，然后进行电化学测定；在室温下将三电极体系放在含有10mM K₃[Fe(CN)₆]和0.5M KCl溶液中进行表征；利用差分脉冲伏安法在含0.1M KCl的pH 8.0的磷酸缓冲溶液中以100mV/s的扫速扫描，电位扫描范围为‑0.7～0.1V；优选的，所述的DNA1的部分序列为：5'‑NH₂‑(CH₂)₆‑ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAAGGT‑3'；优选的，所述的DNA2的部分序列为：5’‑SH‑(CH₂)₆‑TTT TTC CCC CTT TCC CCC TTT CCC CCT TTC CCC C‑3’；优选的，所述的DNA3的部分序列为：5'‑SH‑(CH₂)₆‑TCC TTC CTC CGC AAT GTC CCC CCAAAC‑3’。