[发明专利]恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法

摘要

本发明公开了恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：先对恶性胸腔积液样本进行去细胞处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用EpCAM抗体标记磁珠吸附，从恶性胸腔积液中分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体。本发明方法简单可行，首次实现了胸腔积液中肿瘤源外泌体的提取；本发明方法方便有效，实现了胸腔积液中可检测浓度的肿瘤源外泌体的获得；本发明方法准确可靠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，实现了在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。而且，本发明方法具有特异性强、方便易行、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有较高的临床推广应用价值。

主权项

1.一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：(1)将恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在2～8℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；(3)将所述胸腔积液总外泌体用pH值为7～8的磷酸缓冲液进行重悬得到胸腔积液总外泌体的重悬液，将所述胸腔积液总外泌体的重悬液加入到吸附有上皮细胞粘附分子抗体标记磁珠的第四离心管中，在2～8℃孵育6～16小时后，将所述第四离心管置于磁力架，吸附2～10分钟，移除管内液体，在所述第四离心管中得到磁珠结合的肿瘤细胞来源的外泌体。