[发明专利]恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法

说明书

本发明公开了恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括：先对恶性胸腔积液样本进行去细胞处理，再使用抽提试剂提取总外泌体，然后使用EpCAM抗体标记磁珠吸附，从恶性胸腔积液中分离纯化出肿瘤细胞来源的外泌体。本发明方法简单可行，首次实现了胸腔积液中肿瘤源外泌体的提取；本发明方法方便有效，实现了胸腔积液中可检测浓度的肿瘤源外泌体的获得；本发明方法准确可靠，克服了现有检测总外泌体肿瘤特异性低的缺陷，实现了在胸腔积液中能准确检测到肿瘤来源的外泌体生物信息。而且，本发明方法具有特异性强、方便易行、价格低廉、且能直接用于后续检测的优势，具有较高的临床推广应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。

背景技术

恶性胸腔积液(malignant pleural effusion，MPE)是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液。据统计，美国每年MPE的患者数超过150000人。几乎所有的恶性肿瘤均可出现MPE。肺癌是最常见的病因，约占MPE的1/3，乳腺癌次之，淋巴瘤也是导致出现MPE的重要原因，卵巢癌和胃肠道癌出现MPE者也不少见，5％-10％的MPE找不到原发肿瘤病灶。一旦出现MPE表明肿瘤播散或已进展至晚期，患者预期寿命将显著缩短。MPE从确立诊断开始计算，中位生存期为3-12个月，这与原发肿瘤类型和分期有关。已有证据显示，肺癌所致MPE患者生存期最短，卵巢癌所致MPE生存期最长，无法找到原发灶的MPE患者生存期介于上述两者之间。

由于恶性胸腔积液的病因非常复杂，胸腔积液中的细胞成分也相当复杂，而且MPE确立诊断后，患者生存期都不长，所以，很少有MPE的相关研究工作尤其是其机理和免疫治疗研究工作报道，目前国内外针对MPE流行病学的调查研究资料十分缺乏。当下，临床上诊断和鉴定胸腔积液最常用的方法是采用胸腔穿刺进行细胞学检查，但是该方法存在敏感性较低、主观性较强的弊端，容易造成漏诊或误诊，因此需要寻找新的更敏感可靠的检测指标。

外泌体(Exosome)是一种穿梭在细胞间具有双分子层的纳米级囊泡。外泌体可由多种细胞分泌到细胞外，不同细胞分泌的外泌体可以具有类似的或不同的特性和生物学功能。肿瘤细胞也能释放外泌体，且肿瘤在生长过程中会不断地将外泌体释放到细胞外影响肿瘤微环境，其在肿瘤发生、发展中所扮演的角色已经越来越受关注。外泌体不仅在外周循环中能稳定存在，还能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息(miRNA、蛋白等)，在肿瘤生长与转移中发挥调控作用。

外泌体也能被肿瘤细胞释放在胸腔积液中，但是其为什么会被肿瘤释放到胸膜内以及发挥何种作用尚不清楚。现有的从胸腔积液中提取外泌体的方法复杂且设备要求高，例如，文献报道了蔗糖梯度超离心法提取胸腔积液的外泌体的方法，该方法步骤繁杂费时，损耗量大，而且还需配置超高速离心机，这些都大大限制了研究者对其的研究。此外，胸腔积液中的外泌体来源复杂，无法评估其中属于肿瘤细胞分泌的外泌体。基于以上的限制，目前尚未有文献公开报道从胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体(exosome)的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，能够从肿瘤患者的胸腔积液中获得高量、特异性高且能直接用于后续的流式技术检测的肿瘤细胞来源的外泌体。

一种恶性胸腔积液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法，依次包括以下步骤：

(1)将恶性胸腔积液样本收集于第一离心管中，在2～8℃、300～500g离心10～15分钟，分离得到上层液体；将所述上层液体移入第二离心管中，在2～8℃、10000～12000g离心10～15分钟，分离得到上清液；

(2)将所述上清液与总外泌体抽提液以1:1的体积比在第三离心管混合，震荡均匀后，2～8℃孵育6～16小时，然后，将孵育后的混合液在2～8℃、10000～12000g离心60～80分钟，移除上层清液后，在所述第三离心管的底部得到固相物质，为胸腔积液总外泌体；