[发明专利]一种hUC-MSC的无血清分步培养方法及采用所述方法获得的hUC-MSC

摘要

本发明公开了一种人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC‑MSC)无血清培养方案。该方案采用分步法培养hUC‑MSC：先使用TME培养基培养3‑4小时促进hUC‑MSC贴壁，然后更换为TMD培养基进行快速扩增。TME和TMD无血清分步培养法很好地解决了hUC‑MSC无血清培养方法中细胞贴壁能力差、增殖缓慢、易分化等问题，为hUC‑MSC进行长期稳定的无血清培养技术奠定基础。

主权项

1.一种用于hUC‑MSC的无血清分步培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将hUC‑MSC以0.5‑4×10⁴个细胞/cm²的密度接种于TME培养基中进行贴壁培养，其中，所述TME培养基由0.1体积份的β‑巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液和99体积份的a‑MEM组成，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8‑12mM的甘氨酸、丙氨酸、L‑天门酰胺、L‑天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；(2)培养3‑6小时之后，弃去TME培养基，PBS清洗，更换为TMD培养基，每3‑5天更换新鲜的TMD培养基，其中，所述TMD培养基由0.1体积份的β‑巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a‑MEM/DMEM‑F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子组成，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8‑12mM的甘氨酸、丙氨酸、L‑天门酰胺、L‑天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；(3)待细胞达70‑90％汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；(4)取步骤(3)收集的hUC‑MSC细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。