[发明专利]一种hUC-MSC的无血清分步培养方法及采用所述方法获得的hUC-MSC

权利要求书

1.一种用于hUC-MSC的无血清分步培养方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将hUC-MSC以0.5-4×10⁴个细胞/cm²的密度接种于TME培养基中进行贴壁培养，其中，所述TME培养基由0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液和99体积份的a-MEM组成，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

(2)培养3-6小时之后，弃去TME培养基，PBS清洗，更换为TMD培养基，每3-5天更换新鲜的TMD培养基，其中，所述TMD培养基由0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子组成，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

(3)待细胞达70-90％汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；

(4)取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述hUC-MSC为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

(1)将hUC-MSC以2×10⁴个细胞/cm²的密度接种于TME培养基中进行贴壁培养；

(2)培养3-4小时后，弃去TME培养基，PBS清洗1次，更换为预先37℃孵育的TMD培养基，每3天更换新鲜的TMD培养基；

(3)待细胞达90％汇合后，收集细胞备用、冻存或重复步骤(1)和(2)传代培养；

(4)取步骤(3)收集的hUC-MSC细胞，检测以下项目中的全部：分化能力、细胞活性、细胞纯度、细胞污染和增殖特性。