[发明专利]一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法

摘要

本发明涉及一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，将纳米复合材料配置成为分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中混合，在酶解仪中孵育；通过离心分离纳米复合材料，结合MALDI‑TOF MS质谱分析。该纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好的选择性和高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的内源性磷酸化肽的检测。

主权项

1.一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于具体步骤为：将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育30分钟；通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液直接在MALDI‑TOF MS进样靶板上点靶，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5‑二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱分析；其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料，所述的纳米复合材料具体制备步骤如下：（1）、用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40‑60℃下真空干燥；（２）、配置三羟甲基氨基甲烷缓冲液，溶剂采用体积比为1：2的去离子水和乙醇，将步骤（1）所得的酸化石墨烯分散于缓冲液中，超声10分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机械搅拌反应6‑20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40‑60℃下真空干燥；（３）、在异丙醇中分散步骤（2）所得产物，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺和异丙醇钛，搅拌均匀，反应温度为180‑220℃，反应时间为17‑24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40‑60℃下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯；（４）、将步骤（3）所得产物在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基溴化铵去离子水溶液中，超声30分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超声10分钟，于60℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯与乙醇混合液，在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；（５）、步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时，回流两次；（６）、步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40‑60℃下真空干燥。