[发明专利]一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法

摘要

本发明公开了一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，包括MG分子印迹膜的制备、模板的洗脱、半抗原的合成、酶标抗原的合成和检测，利用多巴胺自聚合原理制备MG分子印迹聚合物膜，并将此MG-MIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA快速检测方法。由于所制备的MG-MIPs膜厚度小，使该检测方法具有灵敏和快速的特点，以合成的分子印迹薄膜作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且能够实现对残留孔雀石绿的快速检测。

主权项

一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：（1）MG分子印迹膜的制备取模板分子MG与多巴胺溶于一定pH的Tris‑HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，26～28℃下聚合反应一定时间；（2）模板的洗脱用甲醇：乙酸的体积比为8～10:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜；（3）半抗原的合成将4‑甲酰基苯甲酸、N,N‑二甲基苯胺和无水ZnC1₂溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流23～25h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到CLMG；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在24～26℃下搅拌反应1.5 h，反应产物经等体积三氯甲烷‑四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到CMG；（4）酶标抗原的合成将CMG溶于质量分数为20%的N,N‑二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH 4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入HRP，调pH为7.0，室温反应2.5～3.5h后，得到CMG‑HRP偶联物；（5）检测准确吸取100μL MG‑PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育1.5～2.5h，弃上层溶液，每孔加入150μL底物显色液，显色30min后加入50μL终止液，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。