[发明专利]一种植物线粒体DNA的快速提取方法

摘要

本发明公开了一种植物线粒体DNA的快速提取方法。它首先配制Buffer A(含有三甲基甘氨酸、半胱氨酸)、Buffer B(含BSA)、溶液W1、溶液W2、溶液W3、漂洗液WT和洗脱缓冲液TB；然后将新鲜幼嫩组织预处理后，加入Buffer A研磨，收集过滤液并保持pH7.0以上，收集液经1000g离心后上清液再12000g离心；取沉淀加入Buffer B重悬，再经1000g离心；取上清加入DNase Ⅰ和EDTA反应，再12000g离心；向沉淀中加入溶液W1悬浮沉淀；然后加入溶液W2、W3温和颠倒，离心后取上清液采用吸附柱提取线粒体DNA。本发明能高效、快速得获得高质量的植物线粒体DNA。

主权项

一种植物线粒体DNA的快速提取方法，其特征是，具体包括下述步骤：(1)溶液配制Buffer A：0.4M蔗糖，5mM EDTA，50mM Tris‑HCl，10mM三甲基甘氨酸，8mM半胱氨酸，0.1％BSA和1％PVP，pH 7.8；Buffer B：0.4M蔗糖，1mM EDTA，10mM Tris‑HCl，0.1％BSA，pH7.2；溶液W1：1％葡萄糖，50mM EDTA，25mM Tris‑HCl，pH8.0；溶液W2：0.2mM NaOH，1％十二烷基硫酸钠；溶液W3：5mol/L醋酸钾，pH4.8；漂洗液WT：70％酒精；洗脱缓冲液TB：10mM Tris‑HCl，1mM EDTA，PH＝8.0；其中，70％酒精的百分数为体积比，其余百分数均为质量体积比；(2)预处理取植物新鲜幼嫩组织于4℃环境中暗处理24h，然后在预冷至2‑4℃的蒸馏水中清洗材料或者在终浓度为0.7％(w/v)的次氯酸钠液中浸泡进行消毒；(3)研磨在预冷的研钵中加入Buffer A，再加入预处理的材料进行研磨；研磨后通过4‑8层的医用纱布过滤，收集过滤液并保持其pH在7.0以上；(4)分离线粒体将收集的过滤液于4℃，1000g离心5±1min，收集上清；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；加入Buffer B，用软毛笔重悬绿色沉淀颗粒；然后4℃，1000g离心5±1min，收集上清；加入DNaseⅠ，放置1‑2h；再加入0.5mol/L EDTA，混匀后静止10±2min，终止反应；4℃，12000g离心20±2min，弃掉上清；(5)提取线粒体DNA向沉淀中加入溶液W1悬浮沉淀；然后加入溶液W2，温和颠倒6‑8次，再加入溶液W3，温和颠倒离心管，充分混匀溶液；离心10±2min，吸取上清放入带有核酸硅胶膜的硅胶膜离心吸附柱中，再离心，倒掉废液；向吸附柱中先后2次加入漂洗液WT，离心漂洗吸附柱；最后将吸附柱放入一个干净的离心管中，向核酸硅胶膜中间部位滴加洗脱缓冲液TB，室温放置2‑5min，离心2‑3min，将溶液收集到离心管中，‑20℃保存；上述步骤(2)‑(4)均需要在2‑4℃下进行操作。