[发明专利]预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用

摘要

本发明预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法及应用在引物设计时进行在上、下游引物两端分别加上两个酶切位点，使克隆得到的抗原基因VP19和VP28带有双酶切位点；在进行双酶切时，使目的基因获得粘性末端，再用DNA连接酶将抗原基因VP19和VP28串联克隆至原核表达载体，用以进行原核表达载体；在构建二价DNA疫苗时，需要进行VP19基因改造，即通过引物设计，去除VP19基因的终止密码子；由于在进行引物设计时，VP19基因下游的酶切位点和VP28上游的酶切位点是同一个，所以通过酶切技术，可以使VP19基因和VP28基因串联克隆。

主权项

1.一种预防对虾白斑综合症病毒二价DNA疫苗的制作法，其特征在于，步骤如下：步骤1：设计白斑病毒VP19和VP28基因扩增引物，具体如下：A.依据VP19基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：(1‑1)上游引物：5‑GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC‑3，其中划线处的GGATCC为BamHⅠ；(1‑2)下游引物：5‑GAATTCTTACTGCCTCCTCTTGGGGT‑3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；B.依据VP28基因序列，应用Primer Premier 5软件合成一对引物：(2‑1)上游引物：5‑AGAGAATTCATGGATCTTTCTTTCAC‑3，其中划线处的GAATTC为EcoRⅠ；(2‑2)下游引物：5‑CACAAGCTTTTACTCGGTCTCAGTGC‑3，其中划线处的AAGCTT为XhoⅠ；步骤2：白斑病毒总DNA的提取，具体如下：使用DNA提取试剂盒，对病料虾组织的DNA进行提取；步骤3：白斑病毒VP19的PCR扩增，具体如下：反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(1‑1)的上游引物为40pmol，体积份数为1.5，(1‑2)的下游引物为40pmol，体积份数为1.5，dNTP各10mM，体积份数为2，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25；充分混匀，将反应管置于PCR仪器中，在94℃的条件下进行4min的预变性；在94℃条件下进行变性1min，并在55℃的条件下退火1min；在72℃的条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min；在本步骤中进行退火的装置为中空的罩体(101)，该中空的罩体(101)的上端安装着反应物入口通道(111)与反应物出口通道(112)，于中空的罩体(101)中另外带有同外界相导通的引导杆(102)，所述的引导杆(102)两端带有贯通槽，而所述的引导杆(102)插进中空的罩体(101)中，所述的引导杆(102)的数量为两个以上，均竖直插进中空的罩体(101)中，而且插进中空的罩体(101)中的竖直方向的高度不相等，于中空的罩体(101)的下端带有杂质出口，在进行退火期间，所述的反应物出口通道(112)同吸气装置经由两端带有贯通槽的杆件相连，这样将反应管中的反应物经过反应物入口通道(111)送进中空的罩体(101)后，于吸气装置生成的反向力下，外界气流由引导杆(102)亦导进到中空的罩体(101)中，由此进入的反应物于中空的罩体(101)中同外界气流搅合在一起，凭借若干所述的引导杆(102)，因为插进中空的罩体(101)中的竖直方向的高度不相等，防止导进中空的罩体(101)的反应物阻塞引导杆(102)，外界气流到达中空的罩体(101)中的各种高度，各自对进入的反应物实现了层进式的搅合；这样被带走热量的反应物在反向力下导进吸气装置中，最后经过吸气装置返回反应管；步骤4：白斑病毒VP28的PCR扩增，具体如下：反应体系的体积份数为25，在反应管中依次加入10×buffer 2.5，其中2.5为体积份数，(2‑1)的上游引物为40pmol，体积份数为1.5，(2‑2)的下游引物为40pmol，体积份数为1.5，dNTP各10mM，体积份数为2，DNA模板的体积份数6，Taq酶的体积份数为0.5，然后加水至总体积到体积份数为25，充分混匀，将反应管置于PCR仪器中，在94℃条件下进行4min预变性；在94℃条件下变性1min，在55℃条件下退火1min；在72℃条件下延伸2min，随后进行32次循环，在72℃条件下延伸10min；步骤5：白斑病毒VP19基因和VP28基因片段的克隆，具体如下：A.PCR产物的回收将体积份数为10的VP19基因和VP28基因的PCR产物经琼脂糖电泳检测，在紫外灯下切下特异性目的条带，用胶回收试剂盒进行回收和纯化；B.回收产物与T载体的连接和转化将纯化的VP19基因和VP28基因PCR产物分别与pMD18‑T载体连接并转化受体菌E.coli DH5a，涂布于含氨苄青霉素100μg/mL的LB固体培养基平板上，于37℃的温箱中倒置培养16h；C.重组质粒的酶切鉴定随机挑取LB平板上的白色单菌落，接种于4mL含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h，用质粒抽提试剂盒进行常规小量质粒的提取，对所提质粒pMD18‑T‑VP19基因用BamHⅠ、EcoRⅠ进行酶切鉴定，对质粒pMD18‑T‑VP28基因EcoR、XhoⅠ进行酶切鉴定，以确定质粒构建成功；步骤6：VP19基因和VP28基因测序与序列分析，具体如下：经限制性内切酶鉴定均为阳性‑‑的克隆,进行测序，测序结果经DNA star分子生物学软件分析,分别与GenBank VP19基因和VP28基因的序列进行核苷酸序列同源性分析；步骤7：VP19和VP28基因原核表达重组质粒的构建，具体如下：分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18‑T‑VP19和原核载体pET‑28a(+),EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18‑T‑VP28和原核载体pET‑28a(+)，分别回收目的基因VP19和pET‑28a(+)大片段，目的基因VP28和pET‑28a(+)大片段构建成pET‑28a(+)‑VP19和pET‑28a(+)‑VP28重组表达质粒，具体质粒的提取、酶切回收、连接、转化、鉴定步骤同步骤5，挑选单克隆菌落，于恒温摇床上37℃振荡培养，提取质粒，并用BamHⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，以确定质粒构建成功；步骤8：重组表达质粒pET‑28a(+)‑VP19和pET‑28a(+)‑VP28在大肠杆菌中的表达，具体如下：挑选经过鉴定为阳性的菌落接种于含卡钠青霉素100μg/ml的LB液体培养基中，在37℃下振荡培养过夜，次日按照1:100比例转接于新的LB培养基中，在37℃下振荡培养至对数生长期，测定OD600在0.5时，开始用1mM IPTG进行诱导，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，表达产物用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS‑PAGE鉴定，结果表明包括VP19和VP28成熟蛋白基因片段表达蛋白大小分别为13.6KD和22KD，与理论推算值基本一致；步骤9：DNA疫苗重组质粒pVAX1.0‑VP19和pVAX1.0‑VP28的构建，具体如下：分别用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切克隆质粒载体pMD‑18‑T‑VP19和疫苗载体pVAX1.0，EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切克隆质粒载体pMD18‑T‑VP28和疫苗载体pVAX1.0，分别回收目的基因VP19和pVAX1.0大片段，目的基因VP28和pVAX1.0大片段构建成pVAX1.0‑VP19和pVAX1.0‑VP28重组表达质粒，pVAX1.0‑VP19质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定，还有pVAX1.0‑VP28质粒EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，以确定质粒构建成功；步骤10：多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0‑VP19‑VP28的构建，具体如下：A.依据克隆得到的WSSV vp19基因序列，重新设计一对引物，上游含有BamHⅠ酶切位点，下游含有EcoRⅠ酶切位点，去除终止密码子，所得如下：P1：5‑GGATCCATGGCCACCACGACTAACAC‑3，其中划线处的GGATCCAT为BamHⅠ；P2：5‑GAATTCCTGCCTCCTCTTGGGGT‑3，其中划线处的GAATTCC为EcoRⅠ；然后以pMD18‑T‑VP19质粒为模板，P1，P2为特异引物，PCR法扩增出VP19‑2基因，回收纯化，然后将它克隆到pMD18‑T克隆载体，记为pMD18‑T‑VP192；B.多价DNA疫苗重组质粒pVAX1.0‑VP19‑VP28的构建分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD18‑T‑VP192质粒和pVAX1.0空质粒，回收PVAX 1.0空质粒大片段和VP192小片段，连接构建pVAX1.0‑VP192质粒，然后用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pVAX1.0‑VP192质粒和pMD18‑T‑VP28质粒，连接构建pVAX1.0‑VP19‑VP28质粒，以确定质粒构建成功；接着进行对DNA疫苗在虾体内表达情况的检测，具体如下：A.口服饲料的制备：取pVAX1.0‑VP19、pVAX1.0‑VP28、pVAX1.0‑VP19‑VP28保存的菌种分别进行培养得到菌液，将得到的菌液3L 6000g离心10min，得到菌体，称量菌体重量，将菌体收集到玻璃瓶中，放入超低温冰箱中，待其完全冻结后取出，室温使其融化，反复3次，以反复冻融法灭活菌体；将灭活菌体以1：4的比例拌入饲料中，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变，待饲料干后，为尽量避免包裹于饲料表面的灭活菌很快融入水中，将饲料包裹蛋清，搅拌均匀，于通风处阴干饲料，每天小心搅拌避免饲料受潮霉变，待饲料干后，将制得的饲料以2g/包的量分装好，备用；B.DNA疫苗在虾体内RT‑PCR检测：试验共分为4组，每组10尾虾，分别口服pVAX1.0‑VP19疫苗、pVAX1.0‑VP28疫苗、pVAX1.0‑VP19‑VP28疫苗和空白对照组，分别在免疫10d和20d取3尾虾的虾鳃，用RT‑PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，结果表明，构建的pVAX1.0‑VP19、pVAX1.0‑VP28、pVAX1.0‑VP19‑VP28三组重组质粒分别免疫对虾，在免疫10d和20d取虾鳃，用RT‑PCR法分别扩增VP28基因和VP19基因，在各实验组中，分别扩增出与VP28基因和VP19基因大小相吻合的条带，非免疫组未能检测到，结果表明VP19、VP28基因重组质粒和与两个基因融合的重组质粒均能在虾鳃中转录出mRNA。