[发明专利]一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：所述蛋白将外膜蛋白基因片段克隆入原核表达载体pET-30a得到重组表达载体，将重组表达载体转化大肠杆菌获得重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，经纯化后获得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。本发明方法成功构建了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白，使其可作为对鱼具有保护作用的疫苗，比较研究了嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白pompA在不同FIA作用下对斑点叉尾鮰的免疫效果。为进一步研究ompA及其能否作为基因工程亚单位疫苗的候选成分奠定基础。

主权项

一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：嗜水气单胞菌基因组DNA提取及嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆：从嗜水气单胞菌分离株提取基因组DNA，根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，将得到的PCR扩增产物纯化后，以载体和插入片段物质的量之比1：3的比例克隆入pMD18‑T载体，在含氨苄青霉素的LB平板上挑取阳性克隆，经双酶切和PCR鉴定后，获得阳性克隆提取质粒DNA；步骤二：表达质粒构建：对测序正确的所述阳性克隆提取质粒DNA进行BamHI、HandⅢ酶切，同时用相同的内切酶对表达质粒pET‑30a酶切，胶纯化回收酶切的目的基因片段和pET‑30a载体片段，建立连接反应，得到重组质粒pET‑32a(+)‑pompA，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，抽提质粒，经酶切鉴定、PCR反应阳性鉴定后得到包含重组质粒pET‑32a(+)‑pompA的阳性重组大肠杆菌；步骤三：嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的诱导表达和纯化：将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，将诱导表达的菌液进行超声波破碎和鉴定，洗涤、溶解、过滤后即得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。