[发明专利]一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：嗜水气单胞菌基因组DNA提取及嗜水气单胞菌外膜蛋白基因的克隆：从嗜水气单胞菌分离株提取基因组DNA，根据嗜水气单胞菌外膜蛋白基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增反应，将得到的PCR扩增产物纯化后，以载体和插入片段物质的量之比1：3的比例克隆入pMD18-T载体，在含氨苄青霉素的LB平板上挑取阳性克隆，经双酶切和PCR鉴定后，获得阳性克隆提取质粒DNA；

步骤二：表达质粒构建：对测序正确的所述阳性克隆提取质粒DNA进行BamHI、HandⅢ酶切，同时用相同的内切酶对表达质粒pET-30a酶切，胶纯化回收酶切的目的基因片段和pET-30a载体片段，建立连接反应，得到重组质粒pET-32a(+)-pompA，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，涂布LB平板，挑取单个菌落，接种于LB培养基中培养，抽提质粒，经酶切鉴定、PCR反应阳性鉴定后得到包含重组质粒pET-32a(+)-pompA的阳性重组大肠杆菌；

步骤三：嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的诱导表达和纯化：将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养至OD₆₀₀达0.6时，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L进行诱导表达，将诱导表达的菌液进行超声波破碎和鉴定，洗涤、溶解、过滤后即得嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述特异性引物为：上游引物：5’-CCATGGGCATGTGTTTAC-3’；下游引物：5’-GGATCCGACTGGTAGA-3’，采用NcoI酶切所述上游引物，采用BamH I酶切所述下游引物。

3.根据权利要求2所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的体系为25μL：2×Taq Master Mix 12.5μl，DNA模板1μl，上游引物和下游引物各1.0μl，补加ddH₂O至25μl；所述PCR扩增反应的条件：95℃预变性5min，94℃ 50s，55℃ 30s，72℃ 50s，共30个循环，最后72℃延伸10min，取5μl反应产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。

4.根据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤二中抽提质粒的方法为碱裂解法。

5.根据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中将所述阳性重组大肠杆菌划线接种于Amp抗性的LB平板培养的方法为：37℃培养过夜，次日挑取单菌落接种于10mL LB培养液中，200rpm振荡培养过夜，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于5mL LB培养液中，剧烈振荡培养至OD₆₀₀达0.6。

6.根据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中诱导表达的过程为：诱导4h后，取1mL菌液4℃、12000rpm离心1min，弃去上清；沉淀中加入40μl的Tris-HCl缓冲液和10μl的5×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，然后进行12％SDS-PAGE分析。

7.据权利要求1所述的一种嗜水气单胞菌外膜蛋白基因原核表达蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤三中洗涤、溶解、过滤的过程为：经超声波破碎和鉴定后的所述诱导表达的菌液的沉淀用含2M尿素的包涵体洗涤液洗涤，洗涤后8000r/min离心10min倒去上清，连续3次，每次5min；最后用含6M盐酸胍的缓冲液溶解重组蛋白，溶解至清亮，将溶解后的溶液，用0.45μm孔径的滤膜过滤。