[发明专利]基于LAMP技术检测罂粟壳成分的引物、试剂盒及方法

摘要

本发明公开了基于LAMP技术检测罂粟壳成分的引物、试剂盒及方法，引物正向外引物F35'‑CTGCGAAAACTATTATCGATGA‑3’；反向外引物B35'‑CACGTTTAGGGGTACTGAT‑3’；正向内引物FIP5'‑GCCATGGATTCACCCCAACT‑TTCCCTGAACTGGGGTTAG‑3’；反向内引物BIP5'‑TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG‑TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT‑3’。试剂盒包括LAMP反应液缓冲液0.6mL；引物250μL；荧光染料50μL；d、酶溶液50μL；阳性对照50μL；去离子水1000μL。目的提供一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分用的引物、试剂盒；及方法，该方法具有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。

主权项

一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分用的试剂盒，其特征在于包括以下组分：a、LAMP反应液缓冲液0.6mL；b、引物250μL；c、荧光染料50μL；d、酶溶液50μL；e、阳性对照50μL；f、去离子水1000μL；产品规格：45次；操作方法：1).试剂的配制：a.取‑20℃下保存的各种试剂在室温下解冻，解冻后立即置于冰上保存；b.在冰上配制预混液：取检测所需的反应量，按照下表比例制备一个反应的量，将下表中的组分分别分装在另外准备的预混溶液配制用的灭菌管中：c.分装后轻弹击试管使其混匀，瞬时离心数秒使溶液集中在试管底部；2).加样：往分装好的试管中分别加入制备好的待检测样品的DNA 5μL即10ng，使总量达到25μL，阴性对照反应使用去离子水5μL作为样品，阳性对照反应使用带有罂粟DNA的阳性对照，然后盖上试管盖轻击混合，瞬时离心使反应溶液集中在试管底部；3).扩增：将试管放置在恒温器中，在63℃下保持恒温1小时，然后在80℃下保持恒温5分钟使酶灭活以终止反应；4).检测：使用紫外线照射装置，波长240‑260nm，350‑370nm，从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进行观察，如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧光，而判定为阴性；注意事项及保存条件：所有试剂于‑20℃保存，避免多次反复冻融及造成污染，配制好的预混溶液要立即使用；其中所述引物包括：正向外引物F3：5'‐CTGCGAAAACTATTATCGATGA‐3’；反向外引物B3：5'‐CACGTTTAGGGGTACTGAT‐3’；正向内引物FIP：5'‐GCCATGGATTCACCCCAACT‐TTCCCTGAACTGGGGTTAG‐3’；其中所述正向内引物FIP包含F1c和F2序列：F1c：GCCATGGATTCACCCCAACT；F2：TTCCCTGAACTGGGGTTAG反向内引物BIP：5'‐TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG‐TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT‐3’所述反向内引物BIP包括含B1c和B2序列：B1c：TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG；B2：TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT。