[发明专利]一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法

摘要

本发明涉及一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法，属于基因工程领域；本发明以pEGFP‑N1载体为模板扩增EGFP基因，双酶切后连入质粒pFastBacDUAL，得重组质粒pDUAL‑EGFP；根据Clbi138基因序列及其开放阅读框设计合成引物；以豆天蛾核型多角体病毒基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，回收目的片段，双酶切后连入经同样双酶切的重组质粒pDUAL‑EGFP，得重组质粒pDUAL‑EGFP‑Clbi138；转化含有家蚕核型多角体病毒的大肠杆菌菌株，培养纯化后接种于LB液体培养基，振荡培养，提取重组BmNPV DNA；并通过实验首次证实重组BmNPV的杀虫效率显著增强，半致死浓度比对照组减少11倍，半数致死时间比对照组缩短42.9%，且病虫体内液化更严重，从而达到提高虫害的防治效果，具有明显的经济和生态效益，具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以pEGFP‑N1载体为模板，PCR扩增EGFP基因，经双酶切后连入供体质粒pFastBacDUAL，形成重组质粒pDUAL‑EGFP；（2）根据Clbi138基因序列及其开放阅读框设计并合成引物；（3）以豆天蛾核型多角体病毒（ClbiNPV）基因组DNA作为模板，以步骤（2）合成的引物进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳切胶回收目的片段，经双酶切后，连入经同样双酶切的重组质粒pDUAL‑EGFP，形成重组供体质粒pDUAL‑EGFP‑Clbi138；（4）分别取pDUAL‑EGFP 、pDUAL‑EGFP‑Clbi138转化含有家蚕核型多角体病毒（BmNPV）的大肠杆菌DH10B菌株，涂布于LB平板培养基，静止培养使蓝斑显色充分，挑取白色菌落，进一步在LB平板培养基上划线纯化；将纯化的白色菌落接种于含卡那霉素、四环素、庆大霉素的LB液体培养基，振荡培养后，提取重组BmNPV DNA，分别记为vBmEGFP、vBmEGFP/Clbi138；由该遗传改造方法得到的重组家蚕核型多角体病毒包含来自豆天蛾核型多角体病毒（ClbiNPV）的Clbi138基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；步骤（3）中所述的重组供体质粒pDUAL‑EGFP‑Clbi138中，EGFP基因位于p10启动子下游，Clbi138基因位于多角体基因PH启动子下游。