[发明专利]一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法

说明书

本发明涉及一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法，属于基因工程领域；本发明以pEGFP‑N1载体为模板扩增EGFP基因，双酶切后连入质粒pFastBacDUAL，得重组质粒pDUAL‑EGFP；根据Clbi138基因序列及其开放阅读框设计合成引物；以豆天蛾核型多角体病毒基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，回收目的片段，双酶切后连入经同样双酶切的重组质粒pDUAL‑EGFP，得重组质粒pDUAL‑EGFP‑Clbi138；转化含有家蚕核型多角体病毒的大肠杆菌菌株，培养纯化后接种于LB液体培养基，振荡培养，提取重组BmNPV DNA；并通过实验首次证实重组BmNPV的杀虫效率显著增强，半致死浓度比对照组减少11倍，半数致死时间比对照组缩短42.9%，且病虫体内液化更严重，从而达到提高虫害的防治效果，具有明显的经济和生态效益，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法，属于基因工程领域。

背景技术

利用病毒防治害虫，不仅防治效果好， 而且对人畜安全、对天敌安全、不污染环境、不使害虫产生抗药性。此外，病毒能在环境中积累，在害虫种群中形成流行病而长期控制害虫虫口密度，具有明显的经济和生态效益，是目前比较理想和有发展前途的生物杀虫剂。

杆状病毒杀虫剂以其不污染环境、不破坏生态平衡、对天敌及人畜安全、害虫不易产生抗性、能在田间长期控制害虫种群等优点，成为生物防治研究中的热点，在生产上有着广阔的应用前景。但杀虫速度慢等缺点制约着其进一步推广和应用。基因工程技术为增强杆状病毒杀虫效果提供了潜在的可能性。目前，提高重组杆状病毒杀虫毒性的研究主要集中于利尿激素（DH）基因、保幼激素酯（JHE）基因、蜕皮激素（MH）基因、几丁质酶（Chitinase）基因、增效蛋白（enhancin）基因、Bt基因、神经毒素基因、植物蛋白酶抑制剂基因等（吕鸿声，昆虫病毒分子生物学，中国农业科技出版社，1998年，北京），但多数基因提高杆状病毒杀虫效果尚不理想。

核型多角体病毒(NPV)对鳞翅目幼虫具有很高的致病力，是昆虫病毒种类中最具潜力者，也是研究应用最广泛的一类。目前，国内外商品化生产的昆虫病毒制剂，绝大部分是NPV（核型多角体病毒杀虫剂的开发. 左拴彦等.山西农业大学学报. 1998，,1（4）：302-305）。家蚕核型多角体病毒（BmNPV）属于甲型杆状病毒属，是杆状病毒的一种，也是宿主域较宽的杆状病毒之一，可感染多种农林害虫。为使杆状病毒成为理想的生物杀虫剂，利用生物技术对野生型病毒进行改造是目前提高杆状病毒杀虫效果的最有效最优前景的途径。

豆天蛾核型多角体病毒（Clanis bilineata nucleopolyhedrovirus；Shan-YingZhu, Jian-Ping Yi, Wei-De Shen, Li-Qun Wang, Hua-Gang He, Yong Wang, Bing Liand Wen-Bing Wang. Genomic sequence, organization and characteristics of anew nucleopolyhedrovirus isolated from Clanis bilineata larva，BMC Genomics，2009，10：91）的Clbi138基因（在GenBank中的登录号为DQ504428）全长3111个碱基，其推导的蛋白质序列全长1036个氨基酸，在N端和C端分别具有一个信号肽（SP）和跨膜结构域（TM），并在内部存在一个金属蛋白酶特征序列，即与锌离子结合相关的HEXXH模序。对已完成全基因组测序的杆状病毒进行检索，发现Clbi138同源物在所有II类α-杆状病毒中保守存在，此外还见于桑灯蛾昆虫痘病毒（AmEPV）等。但是，Clbi138及其同源物的功能尚不明确。