[发明专利]一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法

摘要

本发明提供一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，主要包括如下步骤（1）制备含胎牛血清、人表皮生长因子，人碱性成纤维样细胞生长因子和达氏鲟鱼血清的pH值为7.2‑7.4的MEM培养液，于4℃冰箱保存备用；（2）从达氏鲟鱼体内分离出脾脏组织，采用组织块培养法进行原代培养；（3）待细胞生长形成单层，底部覆盖率70%以上时，用0.25%胰酶消化进行传代培养。（4）对生长旺盛，形态均一的脾脏细胞进行液氮冷冻保存及复苏培养。本发明构建的脾脏组织细胞系，增殖快速，形态多呈成纤维样，可连续传代，并可冻存复苏。该构建方法技术简单，易操作，可推广到其它鲟鱼类脾脏细胞的培养，还可望用于达氏鲟物种资源保护及鲟鱼疾病病原尤其是病毒病原的分离鉴定。

主权项

一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：制备专用培养液，细胞的原代培养，细胞的传代培养以及细胞的冷冻保存和复苏，（1）专用培养液的具体制备步骤为：选取健康的达氏鲟，尾静脉取血，分离出的血清过滤除菌后将该达氏鲟鱼血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子添加到Minimum Essential Medium 的基础培养液中，制备成达氏鲟脾脏细胞完全培养液，置于4℃保存备用，所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5%，胎牛血清的体积浓度为30%、青霉素的浓度为200 IU/ml、链霉素的浓度为200 IU/ml、两性霉素B浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml；（2）细胞原代培养的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70%乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用过量的青霉素和链霉素，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪成1mm3的小块，在25℃下，采用胰蛋白酶和胶原酶的混合物对脾脏组织消化5‑8分钟，再将脾脏组织置于步骤（1）的专用培养液中进行悬浮，收集脾脏组织块均匀接种于培养瓶中，25℃下倒置干贴6小时后加步骤（1）制备的专用培养液启动脾脏组织原代培养，培养2‑3d后，得到原代培养的脾脏组织细胞，所述的胰蛋白酶和胶原酶的混合物为质量浓度为0.0625%‑0.25%胰蛋白酶与质量浓度为0.08%‑0.1%胶原酶Ⅱ按体积为1：1的混合物；（3）细胞传代培养的具体步骤为：待脾脏组织细胞从组织块周围迁出形成单层，培养瓶底部覆盖率达70%以上时，开始第1次传代，先吸出所有组织块和培养液，用无菌磷酸缓冲液洗涤两次，再加入质量浓度0.25%胰酶溶液，25℃培箱中消化1‑3分钟，待细胞单层解离成单个细胞后，加入步骤（1）中的专用培养液以中和过量的胰酶溶液，1200r/min离心3‑6分钟，收集细胞并用专用培养液重悬细胞沉淀，将重悬后得到的细胞悬液分别等量接种于两个培养瓶中，25℃培养箱中进行传代培养，每隔3‑4d，重复一次传代培养的步骤，得到传代培养的细胞；（4）细胞的冷冻保存和复苏具体步骤为：在Minimum Essential Medium 基础培养液中加入二甲基亚砜，胎牛血清，青霉素、链霉素、两性霉素B，配制成细胞冷冻保存液，置冰上预冷，取传代培养的细胞，加入胰酶溶液消化2分钟后按照（3）中传代培养的步骤操作得到细胞沉淀，将细胞沉淀用预冷的冷冻保存液重悬，再转入冻存管中，将冻存管放入冻存盒中进行连续降温后，再放入液氮超低温保存；复苏时，取出冷冻的细胞直接投入37℃水浴解冻，离心重悬细胞沉淀，将该细胞沉淀转移至培养瓶中，加入步骤（1）中的专用培养液，且每12‑24小时后更换新鲜达氏鲟脾脏细胞专用培养液，得到贴壁生长的达氏鲟脾脏组织细胞，即，完成达氏鲟脾脏组织细胞系的构建。