[发明专利]一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

达氏鲟(Acipenser dabryanus)又名长江鲟，主要分布在长江中上游干流及金沙江下游，为我国特有鱼类，具有重要的物种价值，被列为国家Ⅰ级保护的水生野生动物。由于过度捕捞、水体污染、水利工程兴建等原因，长江流域中达氏鲟的资源已极为稀少，随着长江上游及金沙江水电工程的建设，其天然资源将受到更加严峻的威胁，如能冷冻保存其卵子或者胚胎，无疑对保护濒危达氏鲟物种是很有意义的。但通常由于野生达氏鲟很难获得成对的成熟亲本，甚至很难得到存活的个体，且卵子或者胚胎的冷冻保存技术难以攻克，迫切需要其它技术来弥补现有技术的不足。对于鱼类来说，保存的细胞既可以长期传代，又可以通过冻存来减少保藏带来的物资消耗。在细胞水平保存物种为未来濒危物种的复活提供了可能。因此，构建濒危鱼类细胞系显得十分必要，既是解决鱼类种质资源保存、可持续繁衍和挽救濒危物种的有效途径之一，也对探索珍稀濒危水生物种种质资源保存具有重要的指导意义，目前，有关脾脏细胞系的构建仅在花鲈、石斑鱼、高首鲟等少数鱼类中有过相关报道，而本发明针对像达氏鲟这种濒危鲟鱼类物种，以达氏鲟脾脏组织为材料，提供了一种适用于达氏鲟脾脏组织细胞系的构建方法，此法也可供中华鲟、白鲟等鲟鱼类细胞培养提供参照。

发明内容

本发明的目的是利用达氏鲟脾脏组织，提供一种达氏鲟脾脏细胞系的构建方法，以满足对达氏鲟及其它濒危鱼类物种保护研究的需要。

本发明的构建方法，包括以下步骤：制备专用培养液，细胞的原代培养，细胞的传代培养以及细胞的冷冻保存和复苏，

(1)专用培养液制备的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，尾静脉取血，分离出的血清过滤除菌后将该达氏鲟鱼血清、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、人表皮生长因子和人碱性成纤维样细胞生长因子添加到Minimum Essential Medium的基础培养液中，制备成达氏鲟脾脏细胞完全培养液，置于4℃保存备用；所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5％，胎牛血清的体积浓度为30％、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。步骤1)中，所述的达氏鲟鱼血清的体积浓度为0.5％，胎牛血清的体积浓度为30％、青霉素的浓度为200IU/ml、链霉素的浓度为200IU/ml、两性霉素B浓度为0.5μg/ml、人表皮生长因子浓度为20ng/ml、人碱性成纤维样细胞生长因子浓度为20ng/ml。

按体积分数计体积浓度为0.5％的达氏鲟鱼血清200-300μl、体积浓度为30％的胎牛血清10-18ml、10000IU/ml的青霉素0.6-1.4ml、10000IU/ml的链霉素0.6-1.4ml、12.5μg/ml的两性霉素B 0.6-1.4ml、10μg/ml的人表皮生长因子80-120μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子80-120μl、Minimum Essential Medium基础培养液30-33ml。进一步优选为：体积浓度为0.5％的达氏鲟鱼血清250μl、体积浓度为30％的胎牛血清15ml、10000IU/ml的青霉素1ml、10000IU/ml的链霉素1ml、12.5μg/ml的两性霉素B 1ml、10μg/ml的人表皮生长因子100μl、10μg/ml人碱性成纤维样细胞生长因子100μl、Minimum Essential Medium基础培养液31.55ml。

(2)细胞原代培养的具体步骤为：选取健康的达氏鲟，在20ppm高锰酸钾溶液中药浴30分钟，再用70％乙醇擦拭鱼体表面2分钟，置于超净工作台中解剖取脾脏组织，用过量的的青霉素和链霉素，两性霉素B的高三抗杜氏磷酸缓冲液连续漂洗若干次后，将脾脏组织剪成1mm³的小块，在25℃下，采用胰蛋白酶和胶原酶的混合物对脾脏组织消化5-8分钟，再将脾脏组织置于步骤(1)的专用培养液中进行悬浮，收集脾脏组织块均匀接种于培养瓶中，25℃下倒置干贴6小时后加步骤(1)制备的专用培养液启动脾脏组织原代培养，培养2-3d后，显微镜镜下可见大量细胞从组织块中迁移出来并贴壁，刚贴壁的细胞形态呈上皮样或成纤维样(图1-A)，及得到原代培养的脾脏组织细胞。