[发明专利]培养人胎盘间充质干细胞的方法

摘要

本发明提供了一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。本发明对人胎盘间充质干细胞的培养方法进行优化，采用该方案来培养人胎盘间充质干细胞所获得的产品不易污染，而且产量高，培养成本低。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

主权项

一种培养人胎盘间充质干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：1) 使用无菌止血钳剥除胎膜的羊膜层，将胎盘蜕膜部分剪下，放入新的培养皿中，用生理盐水洗涤3次；2）将剪取剥离好的胎盘蜕膜放入离心管中，每10ml加入含有10ul头孢哌酮钠注射液及两性霉素b抗生素的基础培养液作为组织备份；从胎盘上分离的胎盘蜕膜组织，置于含10ml生理盐水的培养皿中；3）将上述分离下来的组织胎盘蜕膜组织收集于离心管中，加入45ml生理盐水于50ml离心管中，离心500g/5min，洗涤1‑2遍，弃上清，剪碎成1～4mm³大小的组织块；4）向剪碎的组织块中加入胶原酶II，剪碎的组织块与胶原酶的体积比为1：3；充分混匀后，置于恒温振荡器中，温度为37℃，转速为150rpm，时间为1h；5）在反应完成后，加入消化体积3‑5倍的生理盐水，充分混匀；将消化后的混合液立刻过滤，并将组织块洗涤1‑2次；细胞滤液300g/10min离心，用移液管吸取去掉上清；加入10ml完全培养基，其中含10ul头孢哌酮钠及两性霉素b，吹打后转入培养瓶：6）壁蜕膜组织按每1mL组织块对应接种1个T75细胞培养瓶，将细胞接种到3个T‑75培养瓶中，每瓶含有10mL含抗生素的培养液，其中含10ul头孢哌酮钠及两性霉素b；将培养瓶水平放入 37℃，质量百分比为 5%的 CO₂培养箱中进行原代培养；7）原代培养24‑48h后，进行第一次全量换液，此后每隔3天全量换液一次，放置在培养箱中进行培养；8）原代培养7‑14天后，在原代培养的细胞融合度达到80‑90%时，消化收获；收集培养基900g，并进行5min离心；用10‑20 mL 的生理盐水清洗T‑75培养瓶1次；加入质量百分比为0.125%的复温胰酶3mL；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下进行4‑6min；9）将细胞悬液收集到一个50mL离心管中；用10‑20 mL 的生理盐水清洗T‑75培养瓶，洗液也收集到该50mL离心管中；用100μm细胞过滤器过滤后，300g离心10min，去上清，加生理盐水吹匀细胞，定容至20mL混匀，取0.5mL细胞悬液进行计数，其余细胞悬液离心300g/10min；10）如果P1活细胞总数低于1.5x10⁷，则按上述方法再传代一次；其中活细胞总数包括冻存细胞总数及流式送检数；11）收集最后离心洗涤上清液，送检需氧菌及真菌、厌氧菌及真菌检测；用适量完全培养基重悬细胞团块，并混合均匀。