[发明专利]培养人胎盘间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，尤其是一种培养人胎盘间充质干细胞的方法。

背景技术

干细胞是一种未分化的细胞,有西个基本特性, 一是具有白我复制能力,二是能分化成一种以上的功能细胞,根据分化潜能的大小,干细胞一般分成三类,第一类是全能干细胞(totipotent stem ce11),其可以分化为功能一致的全能细胞,可以发育为月台儿,第二类是多潛能干细胞(pturipotent stem ce1) ,它能够分化为身体中的每种细胞类型,但是不能形成月台盘或胎儿发育所必需的支持组织 。 由于多潛能干细胞的分化港能不是“全体”的,因此不将这种细胞称为“全能”,而且它们不是胚_胎 。 多潛能干细胞进一步特化为多能(mult iPotent)干细胞,其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞 。 多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型 ;例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚月台干细胞(Embryonic stem ce11)具有广泛的潜能,能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞;第三类是成体干细胞(aduit stem ce11)是一种将tF目有终生白我复制(identica1 copies)和白我更新(self-renewa1)能力的未分化细胞,它分布于不同的组织,并可演变成为各种类型的资质细胞。干细胞的分类,主要分为造血干细胞及非造血干细胞 。 造血干细胞主导_[fIL液、免疫方面的疾病,来源例如脐带血 ;非造血干细胞则以细胞分化与修复为主,可应用于中风、糖尿病、老年痴呆等再生医学,来源有所带、胎盘。

间充质干细胞(mesenchyma1 stem ce11 MSC)是可形成多种细胞类型的多能干细胞。间充质干细胞 (MSC) 最早在骨髓中发现,随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分高培养操作简使等特点,正日益受到人们的关注。间充质干细胞的应用范国也越来越广泛。日前国内外已开展了多项临床应用研究,主要疾病类型包括骨关节炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应( GvHD) ，脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。

发明内容

本发明的目的是：提供一种培养人胎盘间充质干细胞的方法，它解决了现有技术存在的易污染、产量低、培养效果差等技术难题。

本发明是这样实现的：培养人胎盘间充质干细胞的方法，包括如下步骤：

1) 使用无菌止血钳剥除胎膜的羊膜层，将胎盘蜕膜部分剪下，放入新的培养皿中，用生理盐水洗涤3次；

2）将剪取剥离好的胎盘蜕膜放入离心管中，每10ml加入含有10ul头孢哌酮钠注射液及两性霉素b抗生素的基础培养液作为组织备份；从胎盘上分离的胎盘蜕膜组织，置于含10ml生理盐水的培养皿中；

3）将上述分离下来的组织胎盘蜕膜组织收集于离心管中，加入45ml生理盐水于50ml离心管中，离心500g/5min，洗涤1-2遍，弃上清，剪碎成1～4mm³大小的组织块；

4）向剪碎的组织块中加入胶原酶II，剪碎的组织块与胶原酶的体积比为1：3；充分混匀后，置于恒温振荡器中，温度为37℃，转速为150rpm，时间为1h；

5）在反应完成后，加入消化体积3-5倍的生理盐水，充分混匀；将消化后的混合液立刻过滤，并将组织块洗涤1-2次；细胞滤液300g/10min离心，用移液管吸取去掉上清；加入10ml完全培养基，其中含10ul头孢哌酮钠及两性霉素b，吹打后转入培养瓶：

6）壁蜕膜组织按每1mL组织块对应接种1个T75细胞培养瓶，将细胞接种到3个T-75培养瓶中，每瓶含有10mL含抗生素的培养液，其中含10ul头孢哌酮钠及两性霉素b；将培养瓶水平放入 37℃，质量百分比为 5%的 CO₂培养箱中进行原代培养；

7）原代培养24-48h后，进行第一次全量换液，此后每隔3天全量换液一次，放置在培养箱中进行培养；

8）原代培养7-14天后，在原代培养的细胞融合度达到80-90%时，消化收获；收集培养基900g，并进行5min离心；用10-20 mL 的生理盐水清洗T-75培养瓶1次；加入质量百分比为0.125%的复温胰酶3mL；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆脱落漂浮，即用离心后的培养基上清终止消化，消化过程在室温条件下进行4-6min；