[发明专利]一种重组人血管舒缓素

摘要

本发明涉及一种高分子量重组人血管舒缓素、制备方法及应用。更具体地，本发明涉及利用哺乳动物细胞培养生产方法和特定的纯化工艺首次获得高分子量重组人血管舒缓素。本发明的高分子量重组人血管舒缓素经SDS‑PAGE电泳测定分子量为43－49KDa糖蛋白，含3个N‑Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asn141，比现有的人尿来源血管舒缓素具有更复杂和更完整的糖基化水平，且具有明显降低了的脱酰胺化水平。本发明获得的高分子量重组人血管舒缓素能显著延长体内半衰期和减少副作用。本发明还涉及高分子量重组人血管舒缓素在治疗脑梗塞的应用研究。

主权项

一种高分子量重组人血管舒缓素的制备方法，其步骤包括：1)构建编码重组人血管舒缓素的基因表达载体：采用人工合成方法获得编码人血管舒缓素的如序列No.1所示的基因，所述序列No.1所示的基因包括前导肽和人血管舒缓素成熟蛋白基因，插入到哺乳动物细胞表达载体pCMV‑DHFR中，获得含有人血管舒缓素目的基因表达载体；2)重组人血管舒缓素在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达：将含有人血管舒缓素蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达目的蛋白的细胞株；所述的细胞转染方法为电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞为DHFR酶缺陷型CHO‑悬浮细胞CHO；3)高密度细胞培养生产重组人血管舒缓素：将上述筛选到的稳定细胞株转入细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×107个/mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加；细胞培养包括在培养基中加入100μM Cu2+，喂饲培养基加入2mM N‑乙酰基‑D‑氨基甘露糖；4)高分子量重组人血管舒缓素的纯化:(1)上层析柱前预处理：将上述含有重组人血管舒缓素的培养液进行离心去除细胞碎片，收集细胞上清液调节pH并离心去除沉淀；(2)阴离子交换柱层析：用同一根阴离子层析柱，使用不同盐浓度值Tris‑HCl+NaCl缓冲液，0.2‑0.4M NaCl穿柱，0.05‑0.15M NaCl挂柱，先后使重组人血管舒缓素蛋白穿柱和挂柱；所述的阴离子交换柱为QAE Sephadex A‑25或QAE Sephadex A‑50；(3)亲和层析柱分步洗脱：采用亲和层析柱Benzamidine Sepharose 4Fast Flow，GE纯化，通过不同盐浓度的洗脱条件，在0.5M NaCl pH7.5低盐浓度下，得到含有高分子量重组蛋白的洗脱液，在1.5M NaCl pH7.5高盐浓度下，去除低分子量重组蛋白；(4)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，处理上述(3)中得到的高分子量重组人血管舒缓素，利用高低分子量的差别，采用GE‑AKTA系统梯度洗脱的方法，进一步去除低分子量重组人血管舒缓素及其他杂质；所述的疏水柱为Phenyl Sepharose 6Fast Flow；(5)低PH灭活病毒：将上述含有高分子量重组蛋白溶液调节PH至3.8,4℃恒温静置1小时，实现病毒的灭活；(6)阴离子交换柱层析：调节上述含有高分子量重组蛋白溶液的pH，使之带负电荷，使目标蛋白结合到阴离子交换柱，实现高分子量重组蛋白的浓缩；所述的阴离子交换柱选自下组中的任一种：Q Sepharose H.P，Q Sepharose F.F，Q Sepharose 4F.F，Q Sepharose XL，QAE Sephadex A‑25，QAE Sephadex A‑50或STREAMLINE Q XL；(7)分子筛凝胶柱纯化：通过凝胶柱纯化，使得高分子量重组人血管舒缓素蛋白得到充分分离；(8)将上述凝胶柱所得溶液通过深层过滤膜，去除病毒残留；最后将分离得到的高纯度高分子量重组人血管舒缓素蛋白用0.22μm微孔滤膜除菌过滤；所述的凝胶柱为Sephadex G75；上述方法制备得到的重组人血管舒缓素具有如下理化指标：由238个氨基酸残基组成一条单链蛋白，其氨基酸序列为序列3，N—末端和C—末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸；SDS‑PAGE电泳测定其分子量为43－49KDa；含有5对S－S键，分别为Cys7－Cys150，Cys26－Cys42，Cys129－Cys196，Cysl61－Cys175以及Cys186－Cys211；该重组人血管舒缓素含3个N‑Link糖基化结合位点，分别位于Asn78、Asn84及Asn141，分子中第Asn84位点的脱酰胺化水平为8.7％，等电点为4.0；该重组人血管舒缓素含有高分子量蛋白比例99％以上。