[发明专利]BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法

摘要

本发明涉及一种BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法，该配体质粒为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明提供了体外表达载体pGEX-4T-3的构建以及MarTX体外表达方法的技术参数。本发明所得到的短链蝎毒素MarTX在pGEX-4T-3系统中被成功表达，其分子量和生物活性与天然MarTX 几乎吻合；重组MarTX 可选择性地阻断BK通道（α+β4），部分抑制mKv1.3通道的电流，但对hKv4.2和hKv3.1a没有明显的调制效应。

主权项

一种BK通道的特异性配体的重组表达方法，其特征在于该方法的具体步骤为： a．基于MarTX的cDNA序列，涉及两对引物，MarTX‑正向引物为：5’‑TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA‑3’，其中包含一个BamH I的酶切位点；MarTX‑反向引物为：5’‑CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT‑3’，其中包含一个Sma I的酶切位点；构建载体质粒pGEX‑4T‑3‑martentoxin；b．根据设计PCR点突变的引物序列：其正向引物为：5’‑GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTG‑3’，其中包含小肠激酶识别位点的DNA序列；反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列，该序列为：5’‑GGATCCACGCGGAACCAGATC‑3’，其中包含一个BamH I位点；以该pGEX‑4T‑3‑martentoxin质粒为模板进行反向PCR，所得产物经纯化回收得该.DNA 回收产物；该反向PCR的反应体系为：pGEX‑4T‑3‑martentoxin 1µl,正向引物 1µl,反向引物 1µl,2.5mmol/L dNTPs 5µl, 10XPCR buffer 5µl,25mmol/L MgCl₂ 2.8µl,2.5U/µl KOD 1µl,ddH₂O 33.2µl；c.将步骤b所得DNA 纯化回收并且将其回收产物磷酸化，并与T4 连接酶连接；d.将步骤c所得产物转化E.coli/DH5α感受态细胞，得到了完整的表达质粒pGEX‑4T‑3‑MarTX；e. 将步骤d所得表达质粒pGEX‑4T‑3‑MarTX转化至大肠杆菌菌株中，以诱导毒素蛋白的表达，在冰浴下超声破碎细胞，得裂解物；f. 将步骤e所得裂解物分离纯化，超滤管脱盐后，小肠激酶酶切并在室温孵育20 h，得酶切产物；g. 将步骤f所得酶切产物经纯化后真空冷冻干燥，使用含有50 mM DTT的Tris‑碱缓冲液（pH 8.0）还原，得重组产物；该重组产物在包含1 mM还原型谷胱甘肽（GSH）和0.1 mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）的0.05 M Tris‑碱缓冲液（pH 8.0，其中有2 M盐酸胍）中重折叠，得到BK通道的特异性配体的重组表达质粒。