[发明专利]一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR1基因的方法

摘要

本发明公开了一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR1基因的方法。它首先根据IFNAR1基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR1基因表达的siRNA；再构建含有IFNAR1 RNAi基因的慢病毒载体；通过上述慢病毒载体，将IFNAR1RNAi基因介导入DF‑1细胞系，沉默IFNAR1基因的表达，提高禽流感病毒在DF‑1细胞系中的增殖滴度。此方法可提高禽流感病毒在DF‑1细胞系中的抗原量达5‑10倍，大大降低疫苗生产成本，不仅能解决疫苗抗原量不足以及生产成本较高的问题，而且推动禽流感生物反应器细胞培养技术的研发进程。

主权项

一种沉默DF‑1细胞系中IFNAR1基因的方法，其特征是，(1)根据IFNAR1基因，设计RNA干扰靶点序列的多个siRNA，进一步筛选出mRNA水平上敲低IFNAR1基因表达的siRNA；所述步骤(1)的筛选方法是：将设计的多个siRNA插入pLKO.1‑TRC克隆载体中，转染DF1细胞，再收获并提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR方法筛选mRNA水平干扰IFNAR1基因的有效siRNA；(2)构建表达上述筛选的IFNAR1基因siRNA的慢病毒载体LV‑IFNAR1‑RNAi；所述慢病毒载体为LV‑IFNAR1‑RNAi的构建方法为：1)根据筛选的siRNA的DNA序列设计合成单链DNA oligo，退火配对产生双链，再通过两端所含的酶切位点直接连入酶切后的RNAi慢病毒载体GV248中，将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，PCR方法鉴定阳性重组质粒GV248‑IFNAR1；2)大量提取重组质粒GV248‑IFNAR1，与辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0混合后通过脂质体转染293T细胞，收集培养48h的细胞上清液，经离心，上清液过滤后得到慢病毒载体LV‑IFNAR1‑RNAi；(3)通过上述慢病毒载体，将IFNAR1基因siRNA导入DF‑1细胞系，沉默IFNAR1基因的表达，提高H5N2型禽流感病毒在DF‑1细胞系中的增殖滴度。