[发明专利]一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法

摘要

本发明涉及细胞分离技术，旨在提供一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法。该方法是将肿瘤组织块加入至胰酶消化液浸泡、孵育，使肿瘤组织块充分消化打散；分离、收集单个细胞经胰酶消化液重悬后进行多次密度梯度离心，再以红细胞裂解液孵育、离心，用含小牛血清的PBS缓冲液重悬；得到溶解的肿瘤浸润淋巴细胞。在本发明中，酶消化结合机械法双重高效分离肿瘤浸润淋巴细胞，与机械法或酶消化法相比，本发明获得肿瘤浸润淋巴细胞存活率高且简便易行。该方法分离所得的肿瘤浸润淋巴细胞在体外经白细胞介素2(IL-2)刺激后可大量增殖，具有特异高效的抗肿瘤活性，为临床治疗肿瘤提供强有力的依据和新的途径。

主权项

一种肿瘤浸润淋巴细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以PBS缓冲液洗涤肿瘤组织块后，置于培养皿中，加入5～10体积倍的胰酶消化液浸泡3小时；(2)将浸泡处理后的肿瘤组织块修剪成0.5mm³的颗粒状后，置培养皿在37℃水浴摇床中，将肿瘤组织与胰酶消化液一并孵育1～2小时，使肿瘤组织块充分消化打散；收集细胞悬液并过200目金属滤网，分离收集单个细胞至50ml离心管中；用胰酶消化液洗涤培养皿2次，将所有液体转移至该50ml离心管中；(3)将前一步骤的50ml离心管放在冰上静置10分钟后，在50g离心机上离心处理2分钟；弃底部沉淀，转移上清液至另一50ml离心管中，在400g离心机上离心处理5分钟，弃上清，加入3ml胰酶消化液重悬；(4)向前一步骤经重悬的离心管中加入密度梯度离心液，进行密度梯度离心；然后收集云雾层细胞，转移至另一玻璃管中，加入3ml胰酶消化液重悬；加入的密度梯度离心液与细胞悬液的质量比为1:1～2，密度梯度离心过程中控制条件为500g×20分钟，加速9减速4，温度10℃；(5)向前一步骤经重悬的离心管中加入1×红细胞裂解液2ml，孵育5分钟后加入2ml PBS缓冲液终止孵育；在400g离心机上离心5分钟，弃上清；以PBS缓冲液洗涤细胞2次后，用含10wt％小牛血清的PBS缓冲液重悬；该离心管中溶解的细胞即为肿瘤浸润淋巴细胞；所述胰酶消化液是以Hanks'平衡液为溶剂，溶液中包括0.05wt％的collagenase type IV和0.001wt％的DNase I，每200ml Hanks'平衡液加入O.111g CaCl₂。