[发明专利]一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法与应用

摘要

一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法和应用。首先分别筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化，分别得到被驯化的Kuenenia.Anammoxidans，Ochrobactrum.sp和Flavobacterium mizutaii。再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷高效降解菌包埋复合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2％CaCl2的混合溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球。应用于低温高盐条件氨氮和石油烃污染水体的净化，微生物量大。显然本发明利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷复合菌种，其载体材料来源广泛，制法简单，易于产业化，机械强度高，处理效果好，费用低，对环境也不会造成二次污染。

主权项

一种耐盐耐冷复合菌种固定化方法，首先分别筛选出高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌，然后对上述高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性驯化分别得到耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌、耐盐耐冷反硝化细菌和耐盐耐冷石油降解菌，又将生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液和2%CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球；所述挂膜生物炭球是：将生物炭球置于耐盐耐冷高效复合降解菌富集液中浸泡4‑6天，得到挂膜生物炭球，所述耐盐耐冷高效复合降解菌富集液是在氩气保护下将耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌富集液、耐盐耐冷反硝化细菌富集液和耐盐耐冷石油降解菌的富集液按4：1.5：4.5的比例混合而成的；所述耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球是：将上述挂膜生物炭球与耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液和2%CaCl2的混合溶液中，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷复合菌种固定化生物炭球，上述耐盐耐冷高效降解菌包埋混合液是2%海藻酸钠与12%聚乙烯醇的水溶液与湿菌体按体积比（2‑5）：1的比例混合得到包埋混合液，上述湿菌体是取50ml‑100ml的耐盐耐冷高效复合降解菌富集液经5000‑8000r/min离心10‑15min，去除上清液后，在氩气保护下用无菌水清洗若干次后得到的；所述的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：（1）取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎后过筛，得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；（2）将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得到化学改性生物炭；再将上述的化学改性生物炭置于频率40Hz的微波清洗仪中微波震荡40min‑90min，过滤，恒温干燥后得到物化改性生物炭；（3）再将粘土在恒温干燥箱中干燥，过100目‑200目筛得到粘土粉末；（4）将上述物化改性的生物炭与粘土粉末按质量比为（0.5‑1）：10的比例混合后，加入到硅酸钠和碳酸氢钠用去离子水溶解的混合液中，用制球机制成球粒后，再置于恒温干燥箱中干燥，最后置于马弗炉烧制成生物炭球，上述硅酸钠与粘土质量比为3%，碳酸氢钠与粘土质量比为1.5%；上述马弗炉的烧制条件为：升温速度10℃/min, 温度为300℃‑400℃和保温时间180min，恒温干燥是在60℃‑80℃条件下干燥8h‑12h ；高效厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌的筛选，包括如下步骤：（1）石油降解菌富集培养：称取干重10g‑20g的受石油污染沉积物，加入到盛有100mL石油降解菌富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min‑200r/min， 28℃‑30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个石油降解菌富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高石油降解菌的浓度，得到石油降解菌富集液，上述石油降解菌富集培养基：柴油10g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，NaCl 2g，MgSO4 0.5g，K2HPO4 1g，MnSO4 0.01g，FeSO4 0.04g，蒸馏水1000mL，5%Na2CO3调节pH=7.2；（2）厌氧氨氧化菌富集培养：称取10g‑20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL厌氧氨氧化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件下密封震荡培养数天，得到厌氧氨氧化菌富集液，上述厌氧氨氧化富集培养基：NH4HCO3 0.044g，NaNO2 0.017g，KH2PO4 0.057g ，MgCl2·6H2O 0.165g，CaCl2·2H2O 0.3g，NaHCO3 0.105g，EDTA 0.02g，FeCl2·4H2O 0.005g，ZnCl2 0.255mg，CoCl2·6H2O 0.3mg，MnCl2·4H2O 1.238mg，CuCl2·2H2O 0.213mg，NiCl2·6H2O 0.238mg，H3BO3 0.014mg，Na2MO4·2H2O 0.304mg，NaWO4·2H2O 0.063mg，NaSeO3 0.061g，蒸馏水 1000mL，调节 p H值为7.0～7.2；（3）反硝化细菌富集培养：称取10g‑20g的厌氧沉积物加入到盛有100mL反硝化富集培养基的250mL密封培养瓶中，利用氩气将瓶内空气排空，于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件下密封震荡培养数天，得到反硝化细菌富集液，上述反硝化富集培养基：KNO3 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，MgSO4·7H2O 1.0g，1％溴百里酚蓝酒精溶液5 mL，KH2PO4 1.0g ，CaCl2·2H2O 8.5g，柠檬酸钠8.5g，蒸馏水 1000mL，调节 p H值为7.0～7.2；（4）石油降解菌纯化分离：将上述石油降解菌富集液按10‑1‑10‑7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃‑30℃培养3‑7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种石油降解菌；（5）厌氧氨氧化菌纯化分离：将上述厌氧氨氧化菌富集液按10‑1‑10‑7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃‑30℃条件下密封培养3‑7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌；（6）反硝化细菌纯化分离：将上述反硝化细菌富集液按10‑1‑10‑7梯度进行稀释，在氩气保护下涂布在固体培养基上，于28℃‑30℃条件下密封培养3‑7天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种反硝化细菌氨氧化菌；上述固体培养基：胰蛋白胨 10g，酵母浸提物 5g，NaCl 10g，琼脂 15g，蒸馏水 1000mL，调节 p H值为7.0～7.2；所述的厌氧氨氧化细菌、反硝化细菌和石油降解菌进行耐盐和耐冷性的驯化，包括如下步骤：（1）石油降解菌耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种石油降解菌挑取到石油降解菌富集培养基中于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件下震荡培养数天，分别得到石油降解菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，以5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的石油降解菌富集培养基中，于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐石油降解菌；得到耐盐石油降解菌富集液；（2）厌氧氨氧化菌耐盐性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种厌氧氨氧化菌挑取到厌氧氨氧化菌富集培养基中于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到厌氧氨氧化菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的厌氧氨氧化菌富集培养基中，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐厌氧氨氧化细菌；（3）反硝化细菌耐盐性驯化：在氩气保护下将上述分离得到多株纯种反硝化细菌挑取到反硝化细菌富集培养基中于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件下密封震荡培养数天，分别得到反硝化细菌单菌株富集液，待菌株进入对数增长期时，在氩气保护下以5%的接种量依次接种于另一个100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的反硝化细菌富集培养基中，于150r/min‑200r/min，28℃‑30℃的条件震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐反硝化细菌；（4）石油降解菌耐冷性驯化：将上述筛选出的耐盐石油降解菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的石油降解菌富集培养基中富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min‑180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对石油烃降解效果好的石油降解菌即为耐盐耐冷石油降解菌；（5）厌氧氨氧化菌耐冷性驯化：在氩气保护下将上述筛选出的耐盐厌氧氨氧化菌接种到厌氧氨氧化菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min‑180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的厌氧氨氧化细菌即为耐盐耐冷厌氧氨氧化细菌；（6）反硝化细菌耐冷性驯化：在氩气保护下将上述筛选出的耐盐反硝化细菌以富集液与富集培养基5%的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的反硝化细菌富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min‑180r/min的条件下密封震荡培养数天，筛选出对硝态氮降解效果好的反硝化细菌即为耐盐耐冷反硝化细菌。