[发明专利]一种高产多糖小球藻种的分离方法

摘要

本发明涉及经济微藻研究与开发应用，旨在提供一种分离高产多糖小球藻种的方法。该方法是在Basal培养液中加入甘油、鼠李糖和维生素C配制成高产多糖小球藻种的培养液HPSC‑M；从野生铁皮石斛茎上分离附生藻，并经高温干燥环境下进行压力筛选，获得高产多糖的小球藻。本发明方法与传统选育方法相比，具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点，可为小球藻育种等提供必要的技术方法。

主权项

1.一种高产多糖小球藻种的分离方法，包括以下步骤：(1)在1L的Basal培养液中，依次加入1.5ml甘油、2g鼠李糖、0.5g维生素C，充分搅拌溶解，配制成高产多糖小球藻种的培养液，记为HPSC‑M；(2)用浸蘸HPSC‑M的棉签轻拭野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5ml HPSC‑M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭‑润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛绢过滤；(3)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度30℃，光照60μmol·m‑2·s‑1，待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD560达0.8时，用HPSC‑M稀释使OD560至0.2，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD560达0.8的藻液达100ml；(4)将上述OD560达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10‑15min，小心倾去上清液后即得藻泥；(5)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为45℃、相对湿度RH为20％、光照强度60μmol·m‑2·s‑1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用100ml的HPSC‑M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度30℃、光照60μmol·m‑2·s‑1的恒温光照培养箱，过10d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长；(6)取5ml步骤(5)中恢复生长的藻液，用100目的尼龙筛绢过滤，滤液用HPSC‑M稀释至OD560约为0.1；(7)在超净工作台中，将经115℃高压灭菌25min后的含1％琼脂粉的HPSC‑M倒入培养皿中制成固体平板，取30μl步骤(6)中稀释后的藻液均匀涂布于平板上，正面放置10min后倒置培养于温度30℃、光照60μmol·m‑2·s‑1的恒温光照培养箱中，观察平板上藻的生长情况；(8)约一周后可见平板上有藻落长出，在超净工作台中用接种针挑取圆形的单藻落转接至装有0.5mL HPSC‑M的1.5mL离心管中，置于温度30℃、光强60μmol·m‑2·s‑1的恒温光照培养箱中培养，观察离心管中藻的生长情况；(9)当藻液较绿时，取少许于载玻片上作显微观察，并依据培养物的形状学特征鉴别是否为小球藻的纯培养物；若未获得小球藻的纯培养物，可挑较纯的藻落再涂布平板分离，直至获得小球藻纯培养物；(10)对获得的小球藻纯培养物在温度30℃、光强60μmol·m‑2·s‑1下培养，当OD560达0.8时加入HPSC‑M稀释至OD560为0.2，逐级进行扩大培养；(11)将获得的纯小球藻种按步骤(10)培养OD560达0.8的藻液约1L，转入高速离心机的离心管中以8000～12000rpm的转速离心10‑15min，小心倾去上清液，藻泥用100ml重蒸水润洗后，再离心，反复3次；(12)将步骤(11)中洗净的藻泥置于80℃恒温箱中烘至恒重，用硫酸‑苯酚法检验所分离小球藻种的高产多糖特性，所述的高产多糖小球藻种，是指多糖含量比目前多糖含量最高达25.3％的小球藻种Chl‑ZN5‑M2的至少高30％的小球藻种。