[发明专利]表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方法以及应用

摘要

本发明提供了一种表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的蓝耳病病毒(PRRSV)重组质粒的构建方法，及其应用。基于反向遗传操作平台，将海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因插入到pHuN4‑F112基因组中，成功构建了pA‑Rluc和pA‑Fluc这两个重组质粒。转染MARC‑145细胞后，二者均成功拯救出了活病毒，并且发现重组病毒vA‑Rluc、vA‑Fluc与亲本毒vHuN4‑F112具有相似的病毒学特性。将其感染MARC‑145细胞或者PAM细胞之后，获得的荧光素酶活性数值可以成为指征PRRSV在这两种细胞上复制水平的另外一种指标。

主权项

一种表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒，所述重组质粒为pA‑Rluc和pA‑Fluc，其制备方法为利用SOE PCR制备嵌合重组质粒，所述方法具体为：根据pGMR‑TK海肾荧光素酶报告基因载体和pGL3‑Basic萤火虫荧光素报告基因载体中的两个荧光素酶基因序列以及高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4‑F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4‑F112的ORF1b和ORF2之前分别插入Renilla和Firefly Luciferase基因，并在外源基因3′端下游插入此病毒的转录调控序列6，将扩增出的两个嵌合片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4‑F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了两个嵌合重组质粒pA‑Rluc和pA‑Fluc；所述方法中使用的引物为：HF11559：5′‑TCATACATCCGAGTTCCTGTT′‑3′(SEQ ID NO.1)HR13090：5′‑GAAATATTGTCATGGCGAGGC‑3′(SEQ ID NO.2)RLUC‑F2：5′‑TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAG‑3′(SEQ ID NO.3)RLUC‑R1：5′‑TTTGTTCTGGATCATAAACTTTCGAAGTCATTTCAATTCAGGCCTAAAG‑3′(SEQ ID NO.4)RLUC‑F4：5′‑CAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAAATGAACAATAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG‑3′(SEQ ID NO.5)RLUC‑R2/R3：5′‑CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTATTGTTCATTTTTGAGAACT‑3′(SEQ ID NO.6)FLUC‑F2：5′‑TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG‑3′(SEQ ID NO.7)FLUC‑R1：5′‑GGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATTTCAATTCAGGCCTAAAGTT‑3′(SEQ ID NO.8)FLUC‑F4：5′‑CTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG‑3′(SEQ ID NO.9)FLUC‑R2/R3：5′‑CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTACACGGCGATCTTTCCGCC‑3′(SEQ ID NO.10)；具体构建步骤如下：1.1.1扩增SOE‑1PCR产物以pHuN4‑F112作为模板，引物HF11559和Rluc‑R1/Fluc‑R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段SOE‑1；1.1.2扩增SOE‑2PCR产物以pGMR‑TK和pGL3‑Basic质粒为模板，引物Rluc‑F2/Fluc‑F2和Rluc‑R2/R3/Fluc‑R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增SOE‑2；1.1.3扩增SOE‑4PCR产物以pHuN4‑F112作为模板，以Rluc‑F4/Fluc‑F4和HR13090上下游引物对10μM，PCR扩增SOE‑4；1.1.4扩增SOE‑3PCR产物以SOE‑1和SOE‑2PCR回收产物作为模板，以HF11559和Rluc‑R2/R3/Fluc‑R2/R3上下游引物对PCR扩增SOE‑3；1.1.5扩增SOE‑5PCR产物以SOE‑3和SOE‑4PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对10μM，PCR扩增SOE‑5；1.2表达海肾荧光素酶或荧光虫荧光素酶重组PRRSV质粒的构建将上述SOE‑5的PCR产物使用Asc I/EcoR V进行双酶切，再与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4‑F112的大片段通过T4 DNA连接酶连按，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA‑Rluc(SEQ ID NO.11)和pA‑Fluc(SEQ ID NO.12)。