[发明专利]一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法

摘要

本发明公开了一种检测大肠杆菌的生物传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛‑大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层，同时公开了生物传感器的制备方法，本发明提供的生物传感器的电极性能稳定，重复性好，检出限为1.6×10cfu mL‑1。

主权项

一种检测大肠杆菌的生物传感器，其特征在于，从内到外依次为金电极、戊二醛‑大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层；所述的戊二醛‑大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100±10nm，RCA产物层厚度为55±10nm；制备步骤如下：1)制备环状挂锁探针：取3μL挂锁探针、9μL连接探针于已灭菌的100μL离心管内，加入6μL T4 DNA连接酶缓冲溶液，50μL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭；将此离心管放入95℃恒温10min，37℃恒温2h，使之杂交完全；加入2μL T4 DNA连接酶，封口膜封口，16℃恒温2h，等挂锁探针连接完全后，65℃恒温20min使T4 DNA连接酶变性；加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性；2)金电极预处理；3)配制2％的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二次水和PBS缓冲液冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛‑大肠杆菌抗体层；4)待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛‑大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层；5)电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液缓冲，大肠杆菌由于和电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层；6)PBS缓冲液冲洗，在适配体‑引物的PBS缓冲液中孵育，适配体通过与大肠杆菌之间的强识别能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含1μL dNTP、1μL phi29 DNA聚合酶、1μL牛血清白蛋白的溶液中37℃孵育2h完成RCA反应得RCA产物层；所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述适配体‑引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。