[发明专利]一种黄曲霉毒素B1的检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种黄曲霉毒素B1的检测试剂盒，其包括受体微球、供体微球、生物素化黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B1标准品；其中，所述受体微球包被有黄曲霉毒素B1抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素。还公开了黄曲霉毒素B1的均相免疫检测方法。本发明制备的检测试剂盒中的检测试剂稳定，灵敏、准确，具备适用面广、检测范围宽、灵敏度高、特异性强、检测通量大、线性范围较宽等优点。提供的一种检测黄曲霉毒素B1的方法，一方面，有效降低了非特异性反应的可能性以及背景噪音的影响，显著提高了分析效率和检测灵敏度；另一方面大大缩短检测时间，并可在现场快速检测粮食谷物中的黄曲霉毒素B1残留，检测全过程控制在20分钟之内，检测限符合中国及欧盟的限量标准。

主权项

一种黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，其包括：受体微球、供体微球、生物素化黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B1标准品；其中，所述受体微球包被有黄曲霉毒素B1抗体，所述供体微球包被有链霉亲和素；还包括70％甲醇溶液和NaCl；所述受体微球包被有黄曲霉毒素B1抗体的具体步骤如下:(1)抗体的预处理将一定量黄曲霉毒素B1抗体加入美国Millipore公司的带有滤膜的离心管中，9000rpm离心8min；将浓缩后的抗体加入0.2mL缓冲液(1)，9000rpm离心8min后弃掉滤液，此步骤重复5‑6次；将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心管的滤膜反转，8000rpm离心6min，收集所得滤液，即所需要的抗体；完成后再次将滤膜反转，加入50μL缓冲液(1)，静置片刻，使滤膜将待连接抗体的缓冲液(1)吸收，留在滤膜上的残余抗体溶解下来，将滤膜重新反转过来，8000rpm离心6min，收集滤膜上的液体，以上步骤重复1‑3次，以使滤膜上的抗体尽可能多的被回收；(2)抗体浓度的测定采用BCA蛋白定量分析试剂确定步骤(1)中抗体的浓度，按照BCA蛋白定量分析试剂的说明书进行操作，具体步骤如下：1)配置标准品系列浓度：用去离子水将BCA标准品稀释成以下系列浓度:2mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.025mg/mL、0mg/mL；2)配置BCA工作液：根据标准品和样品数量配置BCA工作液，将A液、B液按体积比为50:1的比例进行配置，充分混匀；3)待检测样品用去离子水作适当稀释，将25μL上述标准品及样品分别 加入到96孔透明板的样品孔中；各孔加入200μLBCA工作液，37℃孵育30min；4)将板条放置室温数分钟，将其冷却至室温，用酶标仪570nm波长测定，根据标准曲线计算抗体浓度，并将抗体浓度调整成2mg/mL；(3)抗体和微球的偶联将黄曲霉毒素B1抗体和偶联有二抗的受体微球按照1:10的浓度比进行混匀，用缓冲液(1)将体积补充到200μL，室温下振荡1小时；(4)纯化16000rpm离心15min后去上清，再加入一定量的保存缓冲液将受体微球重悬，再次16000rpm离心15min后去上清，重复此步骤二次，最后用保存缓冲液将其沉淀超声重悬，得到已连接抗体的受体微球，调整受体微球浓度为10μg/mL～50μg/mL待用；(5)保存分装为50μL的小管，4℃保存；所述缓冲液(1)：用0.13mol/L，pH 8.0的PBS配制25mg/mL氰基硼氧化钠，现配现用；所述保存缓冲液：为含有质量百分比为0.2％BSA，体积百分比为0.02％Proclin‑300的PBS溶液，具体配置如下：1L的双蒸水加入KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8g,Na2HPO4·12H2O 3.4g，2gBSA，0.2mL Proclin‑300，混匀，室温保存；其中，上述步骤(3)中抗体和微球的偶联采用水溶性碳二亚胺法，将表面修饰有活性羧基的受体微球与黄曲霉毒素B1抗体共价偶联；所述生物素化黄曲霉毒素B1的具体步骤如下：(1)黄曲霉毒素B1‑牛血清白蛋白偶联物的制备：取10mg黄曲霉毒素B1溶于6ml，其中，甲醇:水:吡啶＝4:1:1，混合液中，加入20mg羧甲基 羟胺半盐酸盐，85℃回流3h，室温放置过夜，蒸除溶剂；取AFB1活化物5mg溶于5mL无水二甲基甲酰胺溶液；加入25mg碳二亚胺盐酸盐，4℃搅拌，避光反应1h；在反应液中加入44mg牛血清白蛋白，继续搅拌反应1h后，4℃下反应16h；反应液用0.01mol/L PBS透析72小时，每8小时更换1次透析液，即得到黄曲霉毒素B1‑BSA偶联物；(2)将NHS‑生物素和黄曲霉毒素B1‑BSA偶联抗原按照1:5的摩尔比进行混匀，室温下振荡4小时，4℃保存透析2天，每12小时换一次透析缓冲液，分装使生物素化黄曲霉毒素B1浓度为1μg/mL～10μg/mL待用；所述透析缓冲溶液中加入Proclin‑300，其浓度优选为0.05％；其中，所述透析缓冲液采用PBS溶液，配置方法为：1L的双蒸水加入KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 3.4g，混匀，室温保存；所述供体微球包被有链霉亲和素，其缓冲液为含25mM HEPES，100mM NaCl和0.05％Proclin‑300，pH7.4的溶液，其中，该供体微球的浓度为10μg/mL～50μg/mL。