[发明专利]用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法

摘要

一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，所述乙二胺四乙酸类探针的化学名称为4-苯砜基-2-氨甲基-6-甲基吡啶-（N-乙二胺基）- N,N´, N´-三乙酸，化学结构式为。本发明的优点是：具有六个配位点的EDTA系列探针，通过苯砜基与蛋白质巯基的反应连接，可直接用于蛋白质标记，如图4。此外，该探针齿合度高、螯合性好、体积较小、刚性稳定、水溶性好，与顺磁金属离子配位后整体呈现电中性，避免了与蛋白质的一些非特异性静电相互作用的发生。

主权项

一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法，其特征在于：所述乙二胺四乙酸类探针的化学名称为4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑6‑甲基吡啶‑（N‑乙二胺基）‑ N,N´, N´‑三乙酸，化学结构式为，其合成步骤如下：1）2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物的合成将2,6‑二甲基吡啶、双氧水和冰乙酸按用量比1g:1.8mL:5mL混合，在60‑90℃下反应5‑10h，旋干溶剂，冰水浴下用饱和碳酸钾溶液调pH至9‑10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色油状液体2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物；2）4‑硝基‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物的合成将上述2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物、浓度为98wt%的硫酸和浓度为98wt%的硝酸按用量比1g:3mL:3.5mL混合，加热回流反应5‑10h，按2‑甲基吡啶‑N‑氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在水浴下用无水碳酸钾调pH至9‑10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色粉末状固体4‑硝基‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物；3）4‑溴‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物的合成将上述4‑硝基‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物、乙酰溴和冰乙酸按用量比1g:10mL:14.5mL混合，在60℃‑90℃下反应6‑13h，按4‑硝基‑2‑甲基吡啶‑N‑氧化物与冰水用量比为1g:25mL加入冰水并在冰水浴下用无水碳酸钾调pH至9‑10，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得到淡黄色固体4‑溴‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物；4）4‑溴‑2‑羟甲基‑6‑甲基吡啶的合成将上述4‑溴‑2,6‑二甲基吡啶‑N‑氧化物、三氟乙酸酐和二氯甲烷按用量比1g:4.5mL:13mL混合，加热回流反应15‑20h，旋干溶剂，按4‑溴‑2‑甲基吡啶‑N‑氧化物与饱和碳酸钾溶液用量比为1g:18mL加入饱和碳酸钾溶液，室温下搅拌2‑5h，依次用乙酸乙酯萃取、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离，得到淡黄色固体4‑溴‑2‑羟甲基‑6‑甲基吡啶；5）4‑溴‑2‑氯甲基‑6‑甲基吡啶盐酸盐的合成将上述4‑溴‑2‑羟甲基‑6‑甲基吡啶、氯化亚砜和二氯甲烷按用量比1g:1mL:10mL混合，加热回流反应3‑6h，旋干溶剂，用无水乙醚洗涤残留物，红外干燥后，得到黄绿色粉末状固体4‑溴‑2‑氯甲基‑6‑甲基吡啶盐酸盐；6）N‑（4‑溴‑2‑氨甲基‑6‑甲基‑吡啶）乙二胺的合成将上述4‑溴‑2‑氯甲基‑6‑甲基吡啶盐酸盐、乙二胺和无水乙腈按质量体积比1g:4.3mL:35.7mL混合，接干燥管，室温搅拌下反应20‑30h，过滤并旋干溶剂，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和碳酸钾溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，得棕黄色油状液体N‑(4‑溴‑2‑氨甲基‑6‑甲基‑吡啶)乙二胺；7）4‑溴‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶的合成将上述N‑（4‑溴‑2‑氨甲基‑6‑甲基‑吡啶）乙二胺、无水碳酸钾、溴乙酸乙酯和无水乙腈按用量比1g:4.5g:4mL:43.8mL混合，氩气保护下室温搅拌反应20‑30h，经过滤并将滤液浓缩至干，柱分离后，得到红棕色油状物液体4‑溴‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶；8）4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶的合成将上述4‑溴‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶、苯亚磺酸钠、四丁基溴化铵和无水乙腈按用量比1g:1.3g:0.08g:33.3mL混合，氩气保护下在60‑80℃下反应13‑20h，溶剂旋干，残留物依次用乙酸乙酯溶解、饱和氯化钠溶液洗涤有机相、无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液浓缩至干，柱分离后，得到淡黄色油状液4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶；9）4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑6‑甲基吡啶‑（N‑乙二胺基）‑ N,N´, N´‑三乙酸的合成将上述4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑[N,N´, N´‑三（乙氧羰基甲基）乙二胺基]‑6‑甲基吡啶、氢氧化钠、无水乙醇和蒸馏水按用量比1g:0.43g:7.3mL:7.3mL混合，室温下搅拌反应5‑10h，分批少量加入H⁺离子交换树脂调pH至3‑4，用无水甲醇洗涤树脂至无荧光，过滤后将滤液浓缩至干，得乳白色固体4‑苯砜基‑2‑氨甲基‑6‑甲基吡啶‑（N‑乙二胺基）‑ N,N´, N´‑三乙酸。