[发明专利]一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法

摘要

本发明公开了一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，采用高效液相色谱法对34株金黄色葡萄球菌和20株非金黄色葡萄球菌建立菌体细胞萃取物色谱图，通过比较确定了金黄色葡萄球菌的特征峰。以金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)为内标物(特征峰)，将特征峰与标准峰的相对保留时间作为数据基础建立金黄色葡萄球菌指纹图谱，将两类指纹图谱的相关系数分布进行分析比较确定限值，构建出指纹图谱的计算方法，从而用于菌种鉴定；该方法在对金黄色葡萄球菌的识别具有一定的可行性、该方法操作简单、耗时短、特异性好，为快速识别检测金黄色葡萄球菌构建了一个新的稳定的技术平台，同时为微生物的识别检测开拓全新的鉴定方法。

主权项

一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、未知菌培养：将未知菌取适量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，得菌悬液；S2、菌体富集：将步骤S1所得的菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，得到富集的菌体；S3、菌体清洗：将灭菌的0.9％的生理盐水加入步骤S2所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，达到清洗菌体的目的；S4、菌体破碎：将10mL的色谱甲醇加入到步骤S3所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，制成菌悬液，将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，取上清备用。S5、样品制备：用旋转蒸发仪将步骤S4所得的混合液浓缩至1‑2mL，经0.45μm有机相微孔滤膜过滤；S6、流动相确定：将待测样品注入高效液相色谱仪，分别以不同比例溶剂系统和不同梯度洗脱进行实验，记录色谱图，选择所得色谱图分离度较好，色谱峰数目也较多的流动相条件，流动相为：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度程序(min/B％)为：0‑15min为90％‑80％；15‑20min为80％‑65％；20‑35min为65％‑5％；35‑40min为5％‑0％；S7、检测波长确定：分别在210nm、240nm和280nm检测波长下将待测样品注入高效液相色谱仪测定色谱图，同时进行全波长扫描，对不同波长下图谱进行叠加、比较分，确定紫外检测器的检测波长为：280nm；S8、流动相流速和色谱柱温度确定：改变流动相的流速，分别为0.5ml/min、0.8ml/min、1.0mi/min，记录色谱图，观察色谱方法中流速对色谱峰保留时间和峰形的影响，确定流速为：0.8mL/min；改变色谱柱的温度，分别为25℃、30℃、35℃，40℃，并记录色谱图，确定柱温为：30℃；S9、进样量确定：改变进样量大小，分别为10μl、20μl，并记录色谱图，观察进样量过小时会导致色谱图峰响应值过小或者没有响应值，进样量过大是否会则导致峰形变化，有没有峰面积误差以及潜在柱过载现象出现，柱分离能力在何种进样量下更高，依据以上标准选择适宜的进样量，确定进样量为：20μL；S10、在上述确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别调节34株金黄色葡萄球菌数量级10³cfu/mL，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，并分别精密吸取各待测样品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，初步建立金黄色葡萄球菌指纹图谱色谱图；S11、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出菌株RS05，RS08，RS30三株屎肠球菌，同样以10³cfu/mL数量级，按2％的接种量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，经离心、洗涤获得富集菌体，将菌体破碎并提取出细胞萃取物，0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，保留时间，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行对比；S12、在以上确定的金黄色葡萄球菌培养方法、前处理方法和液相色谱条件下，分别提取出17株非金黄色葡萄球菌的细胞萃取物，经0.45μm微孔滤膜过滤，加入标准品SPA，并分别精密吸取各供试品溶液20μl，分别进样，记录色谱图，与金黄色葡萄球菌细胞萃取物色谱图进行比对，找出金黄色葡萄球菌特有的色谱峰；S13、指纹图谱匹配和相似度计算：首先，在确定共有色谱峰和SPA内标物标准峰的前提下，对34株金黄色葡萄球菌的共有峰的保留时间计算平均值，计算出每个峰的可信度φ；其次，在确定每个所选出的共有峰及标准峰具有可用性的条件下，计算34株金黄色葡萄球菌色谱图的相似度r；最后，对19株非金黄色葡萄球菌菌株色谱图计算相似度。