[发明专利]一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及菌种鉴别领域，具体涉及一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus SA)是世界上公认的一种重要的食源性病原菌。其广泛存在于在自然界中，作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物暴露的鼻腔、咽喉、毛发上。一方面金黄葡萄球菌可引起局部化脓性炎症，另一方面它可在污染的食品中生长繁殖，可产生肠毒素，引起食物中毒。加强对食品中金黄色葡萄球菌的检测力度是解决该菌污染食品导致食品安全问题的最有效的途径。目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌主要采用传统的分离、培养、生化鉴定的方法，其操作繁琐，检测周期长，已经不能满足食品中致病菌快速检测的需要。而PCR、LAPM技术等分子方法的技术含量比较高，对人员操作、仪器条件及检样环境均有较高的要求，并且容易出现假阳性的检测结果，仍不能满足实际检测的需求。虽然市场上出现了商业产品化的金黄色葡萄球菌快速测试片，但因时有出现判读错误而造成误差的情况，导致不能进行广泛的普及。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，以金黄色葡萄球菌标准菌株和筛选菌株中为研究对象，建立金黄色葡萄球菌指纹图谱，并利用该菌指纹图谱检测食品中金黄色葡萄球菌的污染情况。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种基于指纹图谱的金黄色葡萄球菌鉴别方法，包括如下步骤：

S1、未知菌培养：将未知菌取适量接种于200mL营养肉汤培养基摇床过夜培养12h，得菌悬液；

S2、菌体富集：将步骤S1所得的菌悬液分装于50mL大离心管，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，得到富集的菌体；

S3、菌体清洗：将灭菌的0.9％的生理盐水加入步骤S2所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，弃去上清，达到清洗菌体的目的；

S4、菌体破碎：将10mL的色谱甲醇加入到步骤S3所得的菌体中，漩涡震荡使菌体悬浮，制成菌悬液，将菌悬液于细胞破碎仪中以50％功率超声破碎10min，在4℃下以离心力为6654g，离心6min，取上清备用。

S5、样品制备：用旋转蒸发仪将步骤S4所得的混合液浓缩至1-2mL，经0.45μm有机相微孔滤膜过滤；

S6、流动相确定：将待测样品注入高效液相色谱仪，分别以不同比例溶剂系统和不同梯度洗脱进行实验，记录色谱图，选择所得色谱图分离度较好，色谱峰数目也较多的流动相条件，确定流动相为：流动相A：0.05％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度程序(min/B％)为：0-15min为90％-80％；15-20min为80％-65％；20-35min为65％-5％；35-40min为5％-0％；

S7、检测波长确定：由于蛋白质(标准品SPA)对紫外的最大吸收波长为280nm，而本实验从金黄色葡萄球菌菌体细胞所提取萃取物较为复杂，所以选定分别在210nm、240nm和280nm检测波长下将待测样品注入高效液相色谱仪测定色谱图，同时进行全波长扫描，对不同波长下图谱进行叠加、比较分，确定紫外检测器的检测波长为：280nm；

S8、流动相流速和色谱柱温度确定：改变流动相的流速，分别为0.5ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min，记录色谱图，观察色谱方法中流速对色谱峰保留时间和峰形的影响，确定流速为：0.8mL/min；改变色谱柱的温度，由于柱温过低容易造成色谱柱堵塞，故不可设定过低温度，遂将柱温分别为25℃、30℃、35℃，40℃，并记录色谱图，确定柱温为：30℃；

S9、进样量确定：改变进样量大小，分别为10μl、20μl，并记录色谱图，观察进样量过小时会导致色谱图峰响应值过小或者没有响应值，进样量过大是否会则导致峰形变化，有没有峰面积误差以及潜在柱过载现象出现，柱分离能力在何种进样量下更高，依据以上标准选择适宜的进样量，确定进样量为：20μL；