[发明专利]耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法

摘要

本发明公开了一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突变，本发明在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。

主权项

一种高效表达耐热碱性木聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列插入到表达载体pPIC9K的表达位点，经连接得到重组质粒pPIC9K‑xylGT，所述耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列如SEQ ID NO.1所示；步骤二、将经SalⅠ酶切线性化后的pPIC9K‑xylGT重组质粒电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中，在基本培养基平板上初步筛选到阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选得到重组工程菌GS115/xyl；根据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳性转化子转移到含有0.05％木聚糖的缓冲甲醇培养基平板上,挑选产水解圈大的阳性转化子作为高产木聚糖酶的出发菌；步骤三、在摇瓶培养基础上进行发酵产酶，发酵产酶条件为：pH＝6.9、大豆蛋白胨为1.5％、酵母浸膏为15g/L、甲醇为12mL/L、硫酸镁为0.1％、硫酸钙1.049g/L、硫酸铵为0.45％，于28℃培养5天；步骤四、确定发酵产生的酶的最适作用条件：pH为8.8，反应温度为78℃。