[发明专利]一种获得牡丹单条染色体的方法

摘要

本发明公开了一种获得牡丹单条染色体的方法，通过显微切割技术获得，该方法通过选取减数分裂时期的牡丹细胞，经过样品液制备、镜检、转膜、压片分散牡丹染色体等步骤，得到样品；再用高端激光显微切割系统，通过准备收集管、上样、寻找和选定目标染色体、调节激光参数、目标染色体划线、激光切割进而成功得到牡丹花粉母细胞中完整的单条染色体，且染色体之间没有相互污染，为下游研究做好铺垫。

主权项

一种获得牡丹单条染色体的方法，其特征在于，通过激光显微切割技术获得牡丹单条染色体，包括如下步骤：第一步，样品制备1)样品液制备：选取牡丹花蕾上的雄蕊并进行软化，切取花药，向花药上滴加20～30μl卡宝品红进行染色，并夹碎样品，去掉组织残渣，得到样品液；所述牡丹花蕾的颜色嫩黄、直径为12～16mm；2)镜检：将样品液在普通光学显微镜10～30倍下进行初步观察，判断是否有10％以上的牡丹细胞处于减数分裂后期，如果有10％以上的牡丹细胞处于减数分裂后期，则继续下面实验；如果处于减数分裂后期的牡丹细胞数目小于10％，则重新选取雄蕊；3)转膜：将样品液从普通载玻片转移到覆膜载玻片上，保持覆膜完整；4)压片：用盖玻片盖在覆膜载玻片的样品液上，垂直敲打盖玻片，使染色体散开；压片、揭掉盖玻片、室温晾干覆膜载玻片；第二步，显微切割1)准备收集管：将PCR管固定在激光显微切割仪的收集管架上，向PCR管中加入3～6μl 1％TE溶液；2)上样：将上述晾干的覆膜载玻片倒置固定于激光显微切割仪的样品夹中；3)寻找目标染色体：在显微镜10～30倍镜下寻找目标染色体；4)选定目标染色体：切换显微镜40～63倍镜，调出清晰画面；5)调节激光参数：调节的激光参数为：激光强度范围，15～20；激光孔径1～3；激光切割速度10～15；其他参数为机器设定参数；6)目标染色体划线：画出要切割的目标染色体区域；7)激光切割：自动或手动控制激光切下所选取的目标染色体，并收集至PCR管；小心取下PCR管，并盖严，对PCR管进行离心，使溶有染色体的溶液沉入管底，并于‑40℃～‑80℃保存，备用。