[发明专利]一种获得牡丹单条染色体的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学显微分离技术领域，具体涉及一种获得牡丹单条染色体的方法，特别涉及一种通过激光显微切割分离技术获得牡丹单条染色体的方法。

背景技术

染色体显微切割分离技术是从细胞生物学深入到分子生物学的一项桥梁技术。近年来，该技术在构建基因高分辨遗传图谱和物理图谱，快速有效的获得染色体区带特异性的序列标签位点(STS)及表达序列标签(EST)，构建克隆连锁群，以及在同源基因的定位和克隆等方面显示出巨大的优越性。该技术自80年代初问世以来，最大的突破点就是与PCR技术相结合，之后通过与微克隆、FISH、DNA测序、文库筛选等分子生物学技术相结合，在文库构建、染色体病研究、基因定位与克隆、以及进化遗传学等方面的研究中取得了令人瞩目的成绩，由于该技术具有独特的直接性和实用性，因此在分子生物学领域显示出良好的应用前景。

目前已报道的染色体分离技术主要有玻璃针法、流式细胞法以及激光显微切割技术。染色体显微分离技术产生于20世纪80年代初，1981年，德国的欧洲分子生物学实验室(EMBL)Scalenghe等(Scalenghe E,Tureo E,Edrom J E,etal,1981.Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophila melanogaster Polytene chromosomes.Chromosoma,82:205-16.)用极细玻璃针(直径大约为0.1um)成功分离了果蝇多线期X染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切进行重组克隆了果蝇局部染色体区段，之后玻璃针手工切割技术被应用于部分动物局部染色体的分离，在植物染色体分离方面也有应用，如向日葵，西瓜，烟草，水稻、大豆等染色体的切割分离。玻璃针法虽然费用成本较低，但是手工操作困难，需要很强的显微操作技能。

流式细胞法是根据染色体发出的荧光波长不同从而分离得到各条染色体，该技术是一项自动分离技术，比手工分离的玻璃针方法更便捷，但是用该法一般不能够得到单条染色体，得到的是成百上千条相同或相似的染色体，所以，染色体之间存在很高的污染可能性。

激光显微切割技术即利用全自动激光显微切割系统，在显微镜下通过激光对非均一性样品进行特定分选、收集。全自动激光显微切割系统是DNA、RNA研究及蛋白质组学等研究工作中的最新技术之一，可以最大程度地避免混合样本对精细实验结果造成的细微干扰或误导，从而得到最精确的实验结果(Leica LMD7000激光显微切割中文操作手册)。该系统能够切割病理切片组织、细胞集落、单细胞、染色体以及活细胞等微小样本。激光显微切割技术比手工操作的玻璃针和主要针对多条染色体分离的流式细胞法更加便捷、更加精准，且能够分离单个细胞内的单条或数条染色体。但是，由于激光显微操作系统价格昂贵，所以应用不广泛。

目前，彭仁海等(亚洲棉7号染色体分离及文库构建，棉花学报，2012,24(5)：379～385)，杨红艳(激光显微分离杨树染色体技术研究，北京林业大学，2010)，马有志等(小麦染色体的显微激光分离，遗传学报，26(l)：43-48，1999)，高居荣等(激光显微切割技术切割棉花单条染色体的研究，实验技术与管理，2009)通过激光显微切割获得了单个细胞内的数条染色体或单染色体，但是由于各物种染色体的制备、染色体的分离操作到收集各不相同，现有技术中还没有牡丹或芍药科植物染色体显微分离技术的正式报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得牡丹单条染色体的方法，通过激光显微切割技术获得，该方法中的显微切割过程由人工和电脑共同控制，采用人工划线、激光自动或手动控制切割，在对染色体无损伤的情况下，即可得到牡丹单条完整染色体。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种获得牡丹单条染色体的方法，其通过显微切割技术获得，包括如下步骤：

第一步，样品制备

1)样品液制备：选取牡丹花蕾上的雄蕊并进行软化，切取花药，向花药上滴加20～30μl卡宝品红进行染色，并夹碎样品，去掉组织残渣，得到样品液；

2)镜检：将样品液在普通光学显微镜10～30倍下进行初步观察，判断是否有10％以上的牡丹细胞处于减数分裂后期，如果有10％以上的牡丹细胞处于减数分裂后期，则继续下面实验；如果处于减数分裂后期的牡丹细胞数目小于10％，则重新选取雄蕊；

3)转膜：将样品液从普通载玻片转移到覆膜载玻片上，保持覆膜完整；