[发明专利]一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用

摘要

本发明提供了一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法及其相应重组细胞和应用，本发明旨在通过对传统甲羟戊酸途径进行改造，通过表达外源的乙酰辅酶A合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、乙酰乙酰辅酶A合成酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶，最终在细胞体内建立一条可以利用乙酸为原料合成异戊二烯的新代谢途径。

主权项

一种以乙酸为原料合成异戊二烯的方法，其特征在于它包括以下步骤：(1) 依次构建分别含有acs基因、accs基因的载体pGH‑acs、pGH‑aacs；(2) 构建含有IspS基因的载体pACY‑ispS_Pa；构建含有ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和IDI1基因的载体pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG19‑IDI1； 扩增acc基因的accAD片段，将pCOLADuet‑1载体与accAD片段分别用Pst I和Hind III进行双酶切，酶切后的载体与两端带有相应酶切位点的accAD基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOL‑accAD；扩增acc基因的accBC片段，将pCOL‑accAD与accBC片段分别用Bgl II和Xho I进行双酶切，酶切后的载体与accBC基因片段按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为含有accADBC基因的重组质粒pCOL‑accADBC；所述pGH‑acs与所述载体pCOL‑accADBC分别用Nde I 和Bgl II进行双酶切，酶切后的载体pCOL‑accADBC与外源基因片段acs按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOL‑accADBC‑acs；所述pGH‑aacs与所述载体pCOL‑accADBC‑acs分别用Xho I和 Pac I进行双酶切，酶切后的载体pCOL‑accADBC‑acs与外源基因片段aacs按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pCOL‑accADBC‑acs‑aacs；(3) 扩增HMGS基因，将所述pACY‑ispS_Pa与基因HMGS分别用FseI和PvuI进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段HMGS按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACY‑ispS_Pa‑HMGS；扩增HMGR基因，将pACY‑HMGS‑ispS_Pa与基因HMGR分别用Nco I和BamH I进行双酶切，酶切后的载体与外源基因片段HMGR按摩尔比1:5的比例连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选的阳性克隆为重组质粒pACY‑HMGR‑ispS_Pa‑HMGS；(4) 将载体pACY‑HMGR‑ispS_Pa‑HMGS、pTrc‑ERG12‑ERG8‑ERG19‑IDI1和pCOL‑accADBC‑acs‑aacs共同转化大肠杆菌，涂布于加有卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素抗生素的LB固体平板，获得阳性克隆YJM57工程大肠杆菌；(5) 将活化后的YJM57工程大肠杆菌接种到含有卡那霉素、氯霉素或氨苄霉素的LB液体培养液中培养，当OD_600nm为0.6‑0.8时，在菌液中加入诱导剂至终浓度0.5 mmol·L^‑1，然后转入在30℃下继续诱导培养24h，发酵获得异戊二烯。