[发明专利]多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法

摘要

本发明提供一种在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法，并提供用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基。所述培养基包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基，用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基。本发明方法简单可靠，价格低廉，稳定高效，安全性高，由于采用了悬浮培养系统，可以工业化生产高品质的心肌细胞，无需任何后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于心脏发育科学研究，心脏疾病的细胞治疗，心脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求，具有不可估量的科学和社会经济效益。

主权项

用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基，其特征在于，所述培养基包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基，用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基；所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR、β‑巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、CHIR99021和BIO；所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR、β‑巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、IWP‑2、XAV939和抗坏血酸；所述心肌细胞的长期维持培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR、β‑巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA和抗坏血酸；在所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基中，DMEM/F12混合IMDM的体积比为1:1‑1:3；所述KOSR的浓度为2‑20％；所述NEAA的浓度为0.1‑2％；所述β‑巯基乙醇的浓度为0.1‑1％；所述谷氨酰胺的浓度为10‑200mM；所述CHIR99021的浓度为1‑20μM；所述BIO的浓度为1‑20μM；在所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基中，DMEM/F12混合IMDM的体积比为1:3‑1:5；所述KOSR的浓度为2‑20％；所述NEAA的浓度为0.1‑2％；所述β‑巯基乙醇的浓度为0.1‑1％；所述谷氨酰胺的浓度为10‑200mM；所述IWP‑2的浓度为2‑30μM；所述XAV939的浓度为1‑20μM；所述抗坏血酸的浓度为5‑500μg/L；在所述心肌细胞的长期维持培养基中，DMEM/F12混合IMDM的体积比为1:3‑1:6；所述KOSR的浓度为2‑20％；所述NEAA的浓度为0.1‑2％；所述β‑巯基乙醇的浓度为0.1‑1％；所述谷氨酰胺的浓度为10‑200mM；所述抗坏血酸的浓度为5‑500μg/L。