[发明专利]多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体地说，涉及在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法。

背景技术

心脏疾病是威胁人类健康的常见疾病，尤其是冠心病等造成的心肌缺血导致的心肌梗死病例，每年在美国有150万，在中国有200万。发生心肌梗死后，心室的局部心肌细胞会发生坏死，引起局部结疤而得不到修复，引发心脏心律不全，泵血不足，轻者影响病人的生产和生活，重者引起休克或死亡，严重威胁人类健康和社会稳定。但目前没有很好的治疗方法。干细胞具有长期自我更新以及分化为体内任何细胞的能力，因此使用干细胞分化来的心肌细胞进行替代治疗，为彻底治疗心肌梗死提供了可能。有研究表明，将人类胚胎干细胞定向分化成为心肌细胞，通过注射进入患有心肌梗死的猴子心脏中可以长期存活，形成和猴子原有心肌细胞的细胞连接，产生具有跟猴子心脏一致的心电活动与钙传导信号，明显改善其心脏功能，具有显著的治疗效果。

安全、均质、规模化产生足够量的功能心肌细胞是其应用的前提和关键。另外，心肌药物的筛选同样也需要大量具有功能的心肌细胞。虽然，目前有很多方法可以将干细胞定向分化为心肌细胞，但是心肌细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用。目前将干细胞定向分化为心肌细胞的方法主要包括两种：1)拟胚体(Embryoid bodies,EBs)诱导分化法；2)贴壁诱导分化法。前者是将干细胞消化下来，悬浮培养4-5天形成拟胚体，然后用生长因子和药物诱导后，贴附在培养皿底分化为心肌细胞。但仅20-50％EBs能自发搏动，并且这种方法只能使EBs中50-75％的细胞分化成具有功能的心肌细胞，另外分化的细胞中含有内、中、外三个胚层的非心肌细胞，所以在用于药物筛选和移植前，需要对分化的心肌细胞经过复杂的分选纯化。贴壁分化法是将干细胞以高密度的方式培养在培养皿中，用昂贵的细胞生长因子和小分子组合的培养基进行诱导。贴壁培养方法采用的是平面2D的培养方式，干细胞以单层生长的方式诱导分化，生产能力受到极大的限制，不利于实用化和工业化生产。另外，这些方法一方面需要特殊的基质如martrigel、laminin等；另一方面需要各种昂贵的蛋白生长因子例如ActivinA、BMP4、bFGF等。这些基质和生长因子具有明显的缺陷：成分不明、价格昂贵、不同批次之间存在巨大差异；部分是动物源性的，导致安全性低等。

因此，开发出一种完全是由小分子物质组成的成分限定、高效以及廉价的心肌分化培养基，并利用此培养基，建立一种三维悬浮条件下诱导多能干细胞定向分化为心肌细胞的方法，是本领域亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种在三维(3D)悬浮培养环境中，将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于建立三维悬浮条件下体外诱导心肌细胞分化的培养基，包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基，用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基。

其中，所述用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR(血清替代品)、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、CHIR99021(Wnt信号通路的激动剂)和BIO(Wnt信号通路的激动剂)。

所述用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA、(Wnt信号通路的抑制剂)、XAV939(Wnt信号通路的抑制剂)和抗坏血酸。

所述心肌细胞的长期维持培养基包括：基础培养液为DMEM/F12与IMDM的混合培养基、KOSR、β-巯基乙醇、谷氨酰胺、NEAA和抗坏血酸。

本发明提供的诱导心肌分化的培养基，包括中胚层分化培养基、心肌分化培养基和心肌细胞长期维持培养基，分化培养基中含有多种可供多能干细胞分化为心肌细胞所需的营养成分。其中，CHIR99021和BIO小分子作为Wnt信号激活剂，可以抑制多能干细胞自我更新，促进其往中胚层谱系细胞的分化；IWP-2和XAV939小分子作为Wnt信号通路的抑制剂，促进中胚层前体细胞往心肌前体和心肌细胞分化；抗坏血酸可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且具有促进心肌细胞分化的功能。