[发明专利]一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法

摘要

本发明涉及一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；步骤2，药物组用药物处理；步骤3，各组提取总蛋白；步骤4，质谱上样分析。步骤5，生物信息学分析。

主权项

1.一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；步骤2，药物组用药物处理；步骤3，各组提取总蛋白；用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；步骤4，质谱上样分析采用质谱分析数据ProteinPilot^TMSoftware Beta软件对NCBInr数据库进行检索鉴定蛋白；合并搜库，导出数据用PDST软件分析；同时用m/z对各组报告离子的峰面积积分进行相对定量分析；鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.5被认为存在表达差异；步骤5，生物信息学分析采用DAVID生物学功能注释分析，对差异表达蛋白质进行全面的生物学功能注释，筛选出与斑马鱼神经元损伤相关蛋白；另外对差异表达蛋白进行基于GO分析的生物学过程、细胞组分和分子功能方面的富集分析；使用NCBI的blast工具对与斑马鱼神经元相关的差异蛋白进行了序列比对，获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质，以evalue<0.001作为卡值；以筛选出治疗神经元损伤的预后蛋白标志物；使用MetaCore软件对人同源蛋白质进行了通路分析，获取与神经组织功能相关通路；其中，步骤1采用吗替麦考酚酯作为中枢系统神经毒性诱导剂，诱导建立斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型，并选择模型组、空白组、模型给药组和空白给药组四组对照，每组选用30‑150尾斑马鱼；其中，步骤2所述药物处理，方法如下：除空白组外其余各组均用0.25‑0.4μM吗替麦考酚酯造神经损伤模型；其中，步骤3，各组提取总蛋白；方法如下：蛋白质提取：分别对上述四组斑马鱼加入300‑800μl裂解液于离心管中碾磨，置于冰上裂解10‑20min，超声2‑5min，再置于冰上裂解10‑20min，裂解后，在0‑4℃下10,000‑15,000rpm离心5min，取上清分装于离心管中并置于‑80℃，蛋白质的酶解：用超滤方法将上清液制备为蛋白溶解液，并用bradford方法定量，每组分别取30‑80μg加入1％十二烷基硫酸钠1μL充分混悬溶解样品；加入还原试剂2μL，混匀，60℃反应1小时；加入半胱氨酸封闭试剂1μL，室温反应10分钟；按照酶：蛋白质＝1：50的比例加入trypsin‑胰蛋白酶，35‑40℃酶解过夜，化学标记：选择使用iTRAQ，双相电泳分离分析、差异荧光凝胶电泳分析方法对酶切后的蛋白进行标记；使用高效液相色谱仪对各蛋白进行分离：其中的高效液相色谱仪选自：Agilent 1200；Agilent 1100；色谱柱：选择250×4.6mmC₁₈填料任意品牌的反相色谱柱；流动相：A相：2％ACN‑98％H2O，氨水调pH 10.0；B相：98％ACN‑2％H2O，氨水调pH 10.0；溶剂梯度：5％‑8％B，2min；8％‑32％B，24min；32％‑95％B，26min；95％，33min；95％‑5％B，35min；柱温：40‑50℃；流速：0.5‑0.8mL/min；检测波长：210‑220nm。