[发明专利]一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法

说明书

本发明涉及一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；步骤2，药物组用药物处理；步骤3，各组提取总蛋白；步骤4，质谱上样分析。步骤5，生物信息学分析。

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质分析方法在筛选药物中的用途，特别涉及筛选治疗慢性脑供血不足的一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法

背景技术：

养血清脑颗粒是由天士力自主研发用于治疗血虚肝亢所致的慢性脑缺血不足的中药新药。主要通过改善脑膜微循环，增加脑血流量，显著减轻脑缺血引起的神经缺损症状，明显抑制神经细胞凋亡及突触结构改变，对慢性脑缺血的病理改变起到预防和治疗的作用。缺血再灌注损伤引起神经元损伤作为引起慢性脑供血不足主要原因之一，其引起神经细胞损伤的发病机制尚无定论。因此，研究养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足的作用机制及预后靶标蛋白标志物迫在眉睫。

中药制剂有效部位或有效成分进入机体发挥作用，必然会引起从遗传信息到整体功能实现从分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变。调节这些层面的结构与功能的本质是基因，而直接的作用者主要是蛋白质。在对养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足作用机制研究中，现有对神经细胞凋亡相关基因与神经细胞凋亡相关因子等研究，缺乏以蛋白质表达为指标进行相关药物治疗作用机制方面研究。

本方法采用了与人类基因组同源性高(约87％)，基因组信号调控也相似的一种脊椎动物斑马鱼作为模式动物(专有名词)，利用比较蛋白质组相对定量分析的方法筛选出给药前后的差异蛋白质组。尝试从分子结构水平上来揭示中药组方的复杂作用机制，为后续进行蛋白组学生物质控方法开发提供物质基础。

本发明提供一种用于筛选养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足的关键差异蛋白的分析方法。建立基于斑马鱼神经损伤的药效模型，以养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足的神经元保护作用为生物活性指标，应用蛋白组学方法进行筛选斑马鱼神经元损伤的预后标志物。

本方法应用核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ)技术对四组斑马鱼模型蛋白分别进行标记，结合联合纳升液相色谱和串联质谱(nano liquid chromatography-tandem mass spectrometry，Nano-LC-MS/MS)分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析，对获得的差异蛋白进行生物信息学分析，并使用同源性分析获取斑马鱼神经组织相关蛋白质与人同源的蛋白质。

本方法筛选出了33个与神经元损伤相关的差异表达蛋白质，并为斑马鱼神经元损伤的预后提供了可能的生物标志物。

发明内容：

本发明提供一种应用核素标记相对和绝对定量技术对神经损伤进行蛋白标记，并结合联合纳升液相色谱和串联质谱分离、分析肽段，采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析，从而筛选出养血清脑颗粒在治疗慢性脑供血不足方面的关键差异蛋白的分析方法。

为此，本发明提供一种与神经元损伤相关的差异表达蛋白的分析方法。

本发明所述分析方法，包括以下步骤：

步骤1，斑马鱼脑部和中枢神经损伤模型的构建并分组；

步骤2，药物组用药物处理；

步骤3，各组提取总蛋白；

用蛋白质裂解液裂解，再进行酶解，使用iTRAQ试剂盒进行蛋白标记；用高效液相色谱仪高pH反相色谱分离总蛋白；

步骤4，质谱上样分析