[发明专利]一种制备紫花白及原生质体的方法及其专用试剂

摘要

一种制备紫花白及原生质体的方法，包括如下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；用于该方法的专用试剂包括酶溶液A、B；酶溶液A包括MES、KCl、Mannitol、Cellulase R10、Pectolyase Y‑23、BSA、CaCl₂和ddH₂O，酶溶液B包括MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl₂和ddH₂O。本发明简单易行，实验成本低，可重复性高；利用紫花白及叶片得到的原生质体产量可达4.8×10⁶个/g，活力率为92.26%，可为紫花白及体细胞杂交、突变体诱导、细胞器分离、原生质体转化、生物反应器构建提供良好材料基础。

主权项

一种制备紫花白及原生质体的方法，其特征是，该方法包括如下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定；（1）原生质体的分离：选取紫花白及组培再生苗或野生植株大而饱满的叶片，在超净工作台中将其横向切割为1mm的片段，放入60mm培养皿中，将酶溶液A倒入培养皿里，用镊子将所取材料浸泡入酶溶液A中，pH值为5.7，根据材料的多少来决定酶溶液A的使用量，酶溶液A与材料比例为10ml:1g，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上黑暗处理4 h，震荡条件为26‑28℃、120rpm，即终止酶解，此时原生质体已充分分离出来，用吸头轻轻吹打叶片，以释放出全部原生质体，获得原生质体酶溶液；所述酶溶液A配比如下：成分                    加入量0.2mol/ml MES           1.0ml0.032mol/ml KCl         2.5ml0.16mol/ml Mannitol     5.0mlCellulase R10           150.0mgPectolyase Y‑23         50.0mg10mg/ml BSA             1.0ml0.625mol/ml CaCl₂       400.0ulddH₂O                   100.0ul（2）原生质体的纯化：将原生质体酶溶液用200目的细胞筛过滤，再将滤液置于2ml离心管中，在100g/min下离心3min，使原生质体沉降，然后弃上清液，将沉降物缓慢加入酶溶液B中，在100 g/min的转速下离心3‑5次，每次3min，最终得到纯化的原生质体；（3）原生质体产量的测定：将纯化的原生质体转入2ml酶溶液B中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入酶溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片原生质体数表示；所述酶溶液B配比如下：成分                    加入量0.2mol/ml MES           1.0ml0.032mol/ml KCl         2.5ml0.16mol/ml Mannitol     5.0ml10mg/ml BSA             1.0ml0.625mol/ml CaCl₂       400.0ulddH₂O                   100.0ul；（4）原生质体活力率的测定：利用FDA（荧光素双醋酸酯）透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力；计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。