[发明专利]一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法

摘要

本发明涉及一种应用反应器全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的方法，本发明使用生物反应器全悬浮无血清培养生产PCV2抗原，制备灭活疫苗。该发明方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低90％以上，投入产出比提高4～10倍，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％～70％，产量提高3～5倍，此发明无需载体，无血清残留，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量。

主权项

一种全悬浮细胞培养生产猪圆环病毒2型抗原的方法，该方法包括如下步骤：(1)种子细胞在摇瓶中的培养及传代：在摇瓶中培养保藏号为CCTCC No.C200936的种子细胞PK‑15B1，取样进行细胞计数，当细胞密度达到1～3×106个/ml时，静置摇瓶，待悬浮细胞自然沉降至瓶底后，用吸管吸去1/2～2/3上清，轻轻反复吹打细胞，加入种子细胞生长液后，按照1～3×105个/ml的密度等量分装入数个摇瓶，并在37℃，80～120r/min转速的条件下继续培养；(2)种子细胞的接毒：将前述培养所得的种子细胞PK‑15B1悬液，2000～4000r/min离心5min后，弃去上清，用反应器最终培养液体积3％～5％的保藏号为CGMCC No.2389的PCV2SH株种毒液将细胞重悬起来，并在37℃，80～120r/min的条件下在摇瓶或反应器中维持1h，将接毒后的细胞注入反应器中，并加入细胞生长液，使细胞达到1～3×105个/ml的密度，反应器控制条件为：pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min；(3)病毒的收获和含量测定：待细胞在前述条件下培养了48～72h后取样，进行细胞密度测定，如细胞密度达到1～3×106个/ml，静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，排出1/2～2/3上清，并将细胞维持液补足至培养终培养体积，设定反应器控制条件为：pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min，在该条件下继续培养48～72h后，取样进行细胞活力测定并静置，待悬浮细胞自然沉降至罐体底部后，收获上清，并根据细胞活力测定结果决定补液策略：死细胞数百分比在90％以下时，则继续补加新鲜细胞维持液至培养终体积，并在pH 7.0～7.4，DO 20％～80％，搅拌速度100～150r/min的条件下继续培养48～72h，重复上述过程，直至死细胞数量达到90％以上，将细胞全部收获，将收获的抗原反复冻融3次后再经过滤去除细胞碎片，作为半成品，进行病毒含量测定；(4)用上述制备的猪圆环病毒2型抗原经灭活后加入佐剂进行乳化，制备成疫苗；上述种子细胞生长液的成分按体积比为：低糖DMEM 87％～93.5％，NBCS 5％～10％，双抗1％，硫酸葡聚糖0.5％～2％；上述细胞生长液的成分按体积比为：低糖DMEM 85％～93％，NBCS 5％～10％，双抗1％，D‑氨基葡萄糖0.5％～2％，硫酸葡聚糖0.5％～2％；上述细胞维持液的成分按体积比为：低糖DMEM 93％～97.5％，硫酸葡聚糖0.5～2％，伴刀豆球蛋白A0.5％～2％，水解酪蛋白0.5％～2％，双抗1％。