[发明专利]一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法

摘要

本发明公开了一种检测饲料中微量植酸酶活性的方法。本方法在现有方法的基础上，通过增加称样量和反应体系中的酶液量，能显著提高饲料中植酸酶的检测灵敏度，使线性检测限降低到0.1U/g。当饲料中植酸酶酶活为0.18U/g时，利用本发明所述方法检测的酶活回收率高达98.92％，变异系数仅为0.5％(n＝6)，两次实验的误差小，从而说明本发明提供的方法其准确性和精确度均超过国标GB/T18634-2009《饲用植酸酶活性的测定——分光光度法》的要求，取得意料不到的技术效果。

主权项

一种微量植酸酶活性的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)试剂本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。消洗实验用容器不要用含磷消洗剂。(1.1)0.25mol/L乙酸缓冲液(I)：称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa.3H₂O)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。(1.2)0.25mol/L乙酸缓冲液(II)：称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa.3H₂O)，0.5gTrion x‑100，0.5g牛血消白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。(1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(I)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。(1.4)硝酸溶液：1体积硝酸与2体积水混合均匀。(1.5)100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。(1.6)2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH₄VO₃)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。(1.7)颜色终止液：移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。(1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)(1.9)已知酶活的液体植酸酶(2)测定(2.1)标准曲线称取不含植酸酶的空白饲料试样7份，每份10克，精确至0.0002克，分别加入150ml三角瓶中，加入一个磁力棒，加入一定体积已知酶活的液体植酸酶(1.9)，使每个三角瓶中植酸酶酶活分别约为0u、0.5u、1u、2u、3u、4u、5u、6u。加入乙酸缓冲液(1.1)，使加入液体总体积为50ml，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上消液过0.45um滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001mg)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2），通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定溶至4ml，混合均匀，制成待反应样液。取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物(1.3)开始，向每只试管中加入的时间间隔要绝对一致，37℃水浴30min。反应步骤及试剂、溶液用量见下表。反应顺序样品、标准品样品空白(标准空白)1.加乙酸缓冲液(1.1)1.2ml1.2ml(2.0ml)2.加待反应液0.8ml0.8ml3.混合∨∨4.37℃预热5min∨∨5.依次加入底物(1.3)4ml4ml(第二步)6.混合∨∨7.37℃水解30min∨∨8.依次加入终止液(1.7)4ml4ml(第一步)9.混合∨∨总体积10ml10ml混合后的试样在37℃下显色10min，如出现混浊需在离心机上以7000×g离心10min，上消液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A₀)和样品溶液(A)的吸光值，A‑A₀为实测吸光值。以实测吸光值为横坐标、酶活为纵坐标，列出直线回归方程(y=ax+b)。(2.2)试样溶液的制备取试样，粉碎至全部过20标准筛，装入密闭容器4℃保存。称取试样两份，每份10克，精确至0.0002g，置于150ml三角瓶中，加入50mL乙酸缓冲液(1.1)，一个磁力棒，封口膜封口后在磁力搅拌器上，室温搅拌提取30min。摇匀，取20ml在离心机上以7000×g离心10min。取上消液过0.45um滤膜，取4ml滤液加入已称重(精确至0.0001g)的超滤管，7000×g离心至残留液体积为约0.4ml。将离心管放在分析天平上，加入乙酸缓冲液(1.2)，通过称重(1ml缓冲液＝1.00263g)定容至4ml，混合均匀，制成待反应样液。(2.3)反应操作同回归曲线相应部分。当样品中植酸酶活性低于0.2U/g，反应液加量改为1.6ml，乙酸缓冲液(11)加量为0.4ml。当样品中植酸酶活性高于于0.8U/g，反应液加量改为0.4ml，乙酸缓冲液(1.1)加量为1.6ml。(2.4)样品测定同标准曲线相应部分。得到实测吸光值后，用直线回归方程计算植酸酶的活性。(2.5)结果计算和表示(2.5.1)植酸酶活性计算U＝C/mu‑试样中植酸酶的活性，u/gC‑根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U。m‑试样质量，g。(2.5.2)结果表示两个平行样品的测定结果用算术平均值表示。(2.5.3)重复性同一样品两个平行测定值的相对偏差不大于10％。