[发明专利]一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及酶制剂检测技术领域，具体涉及一种饲料中微量植酸酶活性的检测方法。

背景技术

植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。

由于植酸酶可将底物植酸钠水解，生成正磷酸和肌醇衍生物，并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物，因此，在波长415nm下进行比色，可测定植酸酶活性。目前已形成国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。

但是，饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题：①由于植酸酶在饲料中的添加量较低，现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来；②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应，干扰415nm波长下的比色反应，从而影响酶活测定。

国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》用于测定植酸酶样品，相对较为准确，但是，用于测定添加在饲料中的植酸酶，该方法的检测下限为2.0U/g饲料，而实际饲料中的植酸酶酶活约为0.5U/g饲料，远远低于该方法的检测下限。另外，饲料中无机磷含量远高于反应生成的无机磷量，影响植酸酶与底物的反应。样品空白吸光值超出测定范围。因此，目前急需开发一种准确检测饲料中微量植酸酶含量的方法。

发明内容

本发明为解决现有技术问题提供了一种能够检测饲料中微量植酸酶活性的方法，具体是通过增加称样量和反应体系中的酶液量，有效提高检测的灵敏度。

本发明所采用的技术方案是：本发明所述测定饲料中微量植酸酶活性的方法，其步骤如下：

(1)试剂和溶液的配制

本方法中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。清洗实验用容器不要用含磷清洗剂。

(1.1)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ):称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。

(1.2)0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅱ)：称取34.02g三水乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)，0.5g Trion X－100,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放两个月有效。

(1.3)7.5mmol/L植酸钠溶液：称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ)溶解并定容至刻度，用盐酸调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。

(1.4)硝酸溶液：1体积硝酸与2体积水混合均匀。

(1.5)100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。

(1.6)2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH₄VO₃)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液(1.4)用水溶解定容至刻度。避光条件下保存一周有效。

(1.7)颜色终止液：移取2份硝酸溶液(1.4)，1份钼酸铵溶液(1.5)，1份钒酸铵溶液(1.6)混合使用，现用现配。

(1.8)植酸酶标准品(标明准确活性单位和类型)

(1.9)已知酶活的液体植酸酶

(2)测定

(2.1)标准曲线